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- 详细信息
- 询价记录
- 文献和实验
- 技术资料
- 保存条件：
-20
- 保质期：
2年
- 英文名：
pCP20
- 库存：
100
- 供应商：
上海烜雅生物科技有限公司
- 规格：
干粉/液体
基本信息
名称：pCP20大肠敲除质粒菌种
别称: pCP20
质粒属性
质粒简介
pCP20是一种氨苄青霉素和CmR质粒，显示了FLP合成的温度敏感复制和热诱导。 用pCP20转化CmR和KmR突变体，在30℃下选择氨苄青霉素抗性转化体，之后在43℃选择性地纯化一些，然后测试所有抗生素抗性的损失。 大多数同时失去了FRT侧翼抗性基因和FLP辅助质粒。
质粒图谱
质粒序列
LOCUS Exported 9332 bp ds-DNA circular SYN 27-JUN-2017
DEFINITION synthetic circular DNA
KEYWORDS pCP20
SOURCE synthetic DNA construct
ORGANISM synthetic DNA construct
REFERENCE 1 (bases 1 to 9332)
TITLE Direct Submission
JOURNAL Exported Tuesday, June 27, 2017 from MiaoLingPlasmid
http://www.miaolingbio.com
FEATURES Location/Qualifiers
source 1..9332
/organism="synthetic DNA construct"
/mol_type="other DNA"
CDS complement(561..1220)
/codon_start=1
/gene="cat"
/product="chloramphenicol acetyltransferase"
/note="CmR"
/note="confers resistance to chloramphenicol"
/translation="MEKKITGYTTVDISQWHRKEHFEAFQSVAQCTYNQTVQLDITAFL
KTVKKNKHKFYPAFIHILARLMNAHPEFRMAMKDGELVIWDSVHPCYTVFHEQTETFSS
LWSEYHDDFRQFLHIYSQDVACYGENLAYFPKGFIENMFFVSANPWVSFTSFDLNVANM
DNFFAPVFTMGKYYTQGDKVLMPLAIQVHHAVCDGFHVGRMLNELQQYCDEWQGGA"
promoter complement(1221..1323)
/note="cat promoter"
/note="promoter of the E. coli cat gene encoding
chloramphenicol acetyltransferase"
rep_origin 1875..2097
/note="pSC101 ori"
/note="low-copy replication origin that requires the Rep101
protein"
CDS 2145..3095
/codon_start=1
/gene="rep101 encoding an A56V mutation"
/product="temperature-sensitive version of a protein needed
for replication with the pSC101 origin"
/note="Rep101(Ts)"
/translation="MSELVVFKANELAISRYDLTEHETKLILCCVALLNPTIENPTRKE
RTVSFTYNQYVQMMNISRENAYGVLAKATRELMTRTVEIRNPLVKGFEIFQWTNYAKFS
SEKLELVFSEEILPYLFQLKKFIKYNLEHVKSFENKYSMRIYEWLLKELTQKKTHKANI
EISLDEFKFMLMLENNYHEFKRLNQWVLKPISKDLNTYSNMKLVVDKRGRPTDTLIFQV
ELDRQMDLVTELENNQIKMNGDKIPTTITSDSYLHNGLRKTLHDALTAKIQLTSFEAKF
L-SDMQSKYDLNGSFSWLTQKQRTTLENILAKYGRI"
CDS complement(4557..5417)
/codon_start=1
/gene="bla"
/product="beta-lactamase"
/note="AmpR"
/note="confers resistance to ampicillin, carbenicillin, and
related antibiotics"
/translation="MSIQHFRVALIPFFAAFCLPVFAHPETLVKVKDAEDQLGARVGYI
ELDLNSGKILESFRPEERFPMMSTFKVLLCGAVLSRVDAGQEQLGRRIHYSQNDLVEYS
PVTEKHLTDGMTVRELCSAAITMSDNTAANLLLTTIGGPKELTAFLHNMGDHVTRLDRW
EPELNEAIPNDERDTTMPAAMATTLRKLLTGELLTLASRQQLIDWMEADKVAGPLLRSA
LPAGWFIADKSGAGERGSRGIIAALGPDGKPSRIVVIYTTGSQATMDERNRQIAEIGAS
LIKHW"
promoter complement(5418..5522)
/gene="bla"
/note="AmpR promoter"
CDS complement(6556..7827)
/codon_start=1
/product="site-specific recombinase"
/note="FLP"
/note="FLP is a site-specific recombinase from
Saccharomyces cerevisiae. Recombination occurs at FRT
sequences."
/translation="MPQFDILCKTPPKVLVRQFVERFERPSGEKIALCAAELTYLCWMI
THNGTAIKRATFMSYNTIISNSLSFDIVNKSLQFKYKTQKATILEASLKKLIPAWEFTI
IPYYGQKHQSDITDIVSSLQLQFESSEEADKGNSHSKKMLKALLSEGESIWEITEKILN
SFEYTSRFTKTKTLYQFLFLATFINCGRFSDIKNVDPKSFKLVQNKYLGVIIQCLVTET
KTSVSRHIYFFSARGRIDPLVYLDEFLRNSEPVLKRVNRTGNSSSNKQEYQLLKDNLVR
SYNKALKKNAPYSIFAIKNGPKSHIGRHLMTSFLSMKGLTELTNVVGNWSDKRASAVAR
TTYTHQITAIPDHYFALVSRYYAYDPISKEMIALKDETNPIEEWQHIEQLKGSAEGSIR
YPAWNGIISQEVLDYLSSYINRRI"
CDS 7928..8641
/codon_start=1
/gene="cIts"
/product="temperature-sensitive variant of the phage lambda
repressor"
/note="lambda repressor (ts)"
/note="thermosensitivity is conferred by the A67T mutation"
/translation="MSTKKKPLTQEQLEDARRLKAIYEKKKNELGLSQESVADKMGMGQ
SGVGALFNGINALNAYNAALLTKILKVSVEEFSPSIAREIYEMYEAVSMQPSLRSEYEY
PVFSHVQAGMFSPKLRTFTKGDAERWVSTTKKASDSAFWLEVEGNSMTAPTGSKPSFPD
GMLILVDPEQAVEPGDFCIARLGGDEFTFKKLIRDSGQVFLQPLNPQYPMIPCNESCSV
VGKVIASQWPEETFG"
ORIGIN
1 gagacacaac gtggctttgt tgaataaatc gaacttttgc tgagttgaag gatcagatca
61 cgcatcttcc cgacaacgca gaccgttccg tggcaaagca aaagttcaaa atcaccaact
121 ggtccaccta caacaaagct ctcatcaacc gtggctccct cactttctgg ctggatgatg
181 gggcgattca ggcctggtat gagtcagcaa caccttcttc acgaggcaga cctcagcgcc
241 acaggtgcgg ttgctggcgc taaccgtttt tatcaggctc tgggaggcag aataaatgat
301 catatcgtca attattacct ccacggggag agcctgagca aactggcctc aggcatttga
361 gaagcacacg gtcacactgc ttccggtagt caataaaccg gtaaaccagc aatagacata
421 agcggctatt taacgaccct gccctgaacc gacgaccggg tcgaatttgc tttcgaattt
481 ctgccattca tccgcttatt atcacttatt caggcgtagc aaccaggcgt ttaagggcac
541 caataactgc cttaaaaaaa ttacgccccg ccctgccact catcgcagta ctgttgtaat
601 tcattaagca ttctgccgac atggaagcca tcacaaacgg catgatgaac ctgaatcgcc
661 agcggcatca gcaccttgtc gccttgcgta taatatttgc ccatggtgaa aacgggggcg
721 aagaagttgt ccatattggc cacgtttaaa tcaaaactgg tgaaactcac ccagggattg
781 gctgagacga aaaacatatt ctcaataaac cctttaggga aataggccag gttttcaccg
841 taacacgcca catcttgcga atatatgtgt agaaactgcc ggaaatcgtc gtggtattca
901 ctccagagcg atgaaaacgt ttcagtttgc tcatggaaaa cggtgtaaca agggtgaaca
961 ctatcccata tcaccagctc accgtctttc attgccatac ggaattccgg atgagcattc
1021 atcaggcggg caagaatgtg aataaaggcc ggataaaact tgtgcttatt tttctttacg
1081 gtctttaaaa aggccgtaat atccagctga acggtctggt tataggtaca ttgagcaact
1141 gactgaaatg cctcaaaatg ttctttacga tgccattggg atatatcaac ggtggtatat
1201 ccagtgattt ttttctccat tttagcttcc ttagctcctg aaaatctcga taactcaaaa
1261 aatacgcccg gtagtgatct tatttcatta tggtgaaagt tggaacctct tacgtgccga
1321 tcaacgtctc attttcgcca aaagttggcc cagggcttcc cggtatcaac agggacacca
1381 ggatttattt attctgcgaa gtgatcttcc gtcacaggta tttattcggc gcaaagtgcg
1441 tcgggtgatg ctgccaactt actgatttag tgtatgatgg tgtttttgag gtgctccagt
1501 ggcttctgtt tctatcagct gtccctcctg ttcagctact gacggggtgg tgcgtaacgg
1561 caaaagcacc gccggacatc agcgcttgtt tcggcgtggg tatggtggca ggccccgtgg
1621 ccgggggact gttgggcgcc tgtagtgcca tttaccccca ttcactgcca gagccgtgag
1681 cgcagcgaac tgaatgtcac gaaaaagaca gcgactcagg tgcctgatgg tcggagacaa
1741 aaggaatatt cagcgatttg cccgagcttg cgagggtgct acttaagcct ttagggtttt
1801 aaggtctgtt ttgtagagga gcaaacagcg tttgcgacat ccttttgtaa tactgcggaa
1861 ctgactaaag tagtgagtta tacacagggc tgggatctat tctttttatc tttttttatt
1921 ctttctttat tctataaatt ataaccactt gaatataaac aaaaaaaaca cacaaaggtc
1981 tagcggaatt tacagagggt ctagcagaat ttacaagttt tccagcaaag gtctagcaga
2041 atttacagat acccacaact caaaggaaaa ggactagtaa ttatcattga ctagcccatc
2101 tcaattggta tagtgattaa aatcacctag accaattgag atgtatgtct gaattagttg
2161 ttttcaaagc aaatgaacta gcgattagtc gctatgactt aacggagcat gaaaccaagc
2221 taattttatg ctgtgtggca ctactcaacc ccacgattga aaaccctaca aggaaagaac
2281 ggacggtatc gttcacttat aaccaatacg ttcagatgat gaacatcagt agggaaaatg
2341 cttatggtgt attagctaaa gcaaccagag agctgatgac gagaactgtg gaaatcagga
2401 atcctttggt taaaggcttt gagattttcc agtggacaaa ctatgccaag ttctcaagcg
2461 aaaaattaga attagttttt agtgaagaga tattgcctta tcttttccag ttaaaaaaat
2521 tcataaaata taatctggaa catgttaagt cttttgaaaa caaatactct atgaggattt
2581 atgagtggtt attaaaagaa ctaacacaaa agaaaactca caaggcaaat atagagatta
2641 gccttgatga atttaagttc atgttaatgc ttgaaaataa ctaccatgag tttaaaaggc
2701 ttaaccaatg ggttttgaaa ccaataagta aagatttaaa cacttacagc aatatgaaat
2761 tggtggttga taagcgaggc cgcccgactg atacgttgat tttccaagtt gaactagata
2821 gacaaatgga tctcgtaacc gaacttgaga acaaccagat aaaaatgaat ggtgacaaaa
2881 taccaacaac cattacatca gattcctacc tacataacgg actaagaaaa acactacacg
2941 atgctttaac tgcaaaaatt cagctcacca gttttgaggc aaaatttttg agtgacatgc
3001 aaagtaagta tgatctcaat ggttcgttct catggctcac gcaaaaacaa cgaaccacac
3061 tagagaacat actggctaaa tacggaagga tctgaggttc ttatggctct tgtatctatc
3121 agtgaagcat caagactaac aaacaaaagt agaacaactg ttcaccgtta catatcaaag
3181 ggaaaactgt ccatatgcac agatgaaaac ggtgtaaaaa agatagatac atcagagctt
3241 ttacgagttt ttggtgcatt taaagctgtt caccatgaac agatcgacaa tgtaacagat
3301 gaacagcatg taacacctaa tagaacaggt gaaaccagta aaacaaagca actagaacat
3361 gaaattgaac acctgagaca acttgttaca gctcaacagt cacacataga cagcctgaaa
3421 caggcgatgc tgcttatcga atcaaagctg ccgacaacac gggagccagt gacgcctccc
3481 gtggggaaaa aatcatggca attctggaag aaatagcgcc tgtttcgttt caggcaggtt
3541 atcagggagt gtcagcgtcc tgcggttctc cggggcgttc gggtcatgca gcccgtaatg
3601 gtgatttacc agcgtctgcc aggcatcaat tctaggcctg tctgcgcggt cgtagtacgg
3661 ctggaggcgt tttccggtct gtagctccat gttcggaatg acaaaattca gctcaagccg
3721 tcccttgtcc tggtgctcca cccacaggat gctgtactga tttttttcga gaccgggcat
3781 cagtacacgc tcaaagctcg ccatcacttt ttcacgtcct cccggcggca gctccttctc
3841 cgcgaacgac agaacaccgg acgtgtattt cttcgcaaat ggcgtggcat cgatgagttc
3901 ccggacttct tccggattac cctgaagcac cgttgcgcct tcgcggttac gctccctccc
3961 cagcaggtaa tcaaccggac cactgccacc accttttccc ctggcatgaa atttaactat
4021 catcccgcgc cccctgttcc ctgacagcca gacgcagccg gcgcagctca tccccgatgg
4081 ccatcagtgc ggccaccacc tgaacccggt caccggaaga ccactgcccg ctgttcacct
4141 tacgggctgt ctgattcagg ttatttccga tggcggccag ctgacgcagt aacggcggtg
4201 ccagtgtcgg cagttttccg gaacgggcaa ccggctcccc caggcagacc cgccgcatcc
4261 ataccgccag ttgtttaccc tcacagcgtt caagtaaccg ggcatgttca tcatcagtaa
4321 cccgtattgt gagcatcctc tcgcgtttca tcggtatcat taccccatga acagaaatcc
4381 cccttacacg gaggcatcag tgactaaacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca
4441 cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat
4501 taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacagttac
4561 caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt
4621 gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc tggccccagt
4681 gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca ccggctccag atttatcagc aataaaccag
4741 ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc catccagtct
4801 attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt
4861 gttgccattg ctgcaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc
4921 tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt
4981 agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg
5041 gttatggcag cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg
5101 actggtgagt actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct
5161 tgcccggcgt caacacggga taataccgcg ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc
5221 attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt
5281 tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt
5341 tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg
5401 aaatgttgaa tactcatact cttccttttt caatattatt gaagcattta tcagggttat
5461 tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg
5521 cgcacatttc cccgaaaagt gccacctgac gtctaagaaa ccattattat catgacatta
5581 acctataaaa ataggcgtat cacgaggccc tttcgtcttc aagaatttta taaaccgtgg
5641 agcgggcaat actgagctga tgagcaattt ccgttgcacc agtgcccttc tgatgaagcg
5701 tcagcacgac gttcctgtcc acggtacgcc tgcggccaaa tttgattcct ttcagctttg
5761 cttcctgtcg gccctcattc gtgcgctcta ggatcctcta cgccggacgc atcgtggccg
5821 gcatcaccgg cgctgaggtc tgcctcgtga agaaggtgtt gctgactcat accaggcctg
5881 aatcgcccca tcatccagcc agaaagtgag ggagccacgg ttgatgagag ctttgttgta
5941 ggtggaccag ttggtgattt tgaacttttg ctttgccacg gaacggtctg cgttgtcggg
6001 aagatgcgtg atctgatcct tcaactcagc aaaagttcga tttattcaac aaagccgccg
6061 tcccgtcaag tcagcgtaat gctctgccag tgttacaacc aattaaccaa ttctgattag
6121 aaaaactcat cgagcatcaa atgaaactgc aatttattca tatcaggatt atcaatacca
6181 tatttttgaa aaagccgttt ctgtaatgaa ggagaaaact caccgaggca gttccatagg
6241 atggcaagat cctggtatcg gtctgcgatt ccgactcgtc caacatcaat acaacctatt
6301 aatttcccct cgtcaaaaat aaggttatca agtgagaaat caccatgagt gacgactgaa
6361 tccggtgaga atggcagaat aggaacttcg gaataggaac ttcaaagcgt ttccgaaaac
6421 gagcgcttcc gaaaatgcaa cgcgagctgc gcacatacag ctcactgttc acgtcgcacc
6481 tatatctgcg tgttgcctgt atatatatat acatgagaag aacggcatag tgcgtgttta
6541 tgcttaaatg cgtacttata tgcgtctatt tatgtaggat gaaaggtagt ctagtacctc
6601 ctgtgatatt atcccattcc atgcggggta tcgtatgctt ccttcagcac taccctttag
6661 ctgttctata tgctgccact cctcaattgg attagtctca tccttcaatg ctatcatttc
6721 ctttgatatt ggatcatatg catagtaccg agaaactagt gcgaagtagt gatcaggtat
6781 tgctgttatc tgatgagtat acgttgtcct ggccacggca gaagcacgct tatcgctcca
6841 atttcccaca acattagtca actccgttag gcccttcatt gaaagaaatg aggtcatcaa
6901 atgtcttcca atgtgagatt ttgggccatt ttttatagca aagattgaat aaggcgcatt
6961 tttcttcaaa gctttattgt acgatctgac taagttatct tttaataatt ggtattcctg
7021 tttattgctt gaagaattgc cggtcctatt tactcgtttt aggactggtt cagaattcct
7081 caaaaattca tccaaatata caagtggatc gatcctaccc cttgcgctaa agaagtatat
7141 gtgcctacta acgcttgtct ttgtctctgt cactaaacac tggattatta ctcccagata
7201 cttattttgg actaatttaa atgatttcgg atcaacgttc ttaatatcgc tgaatcttcc
7261 acaattgatg aaagtagcta ggaagaggaa ttggtataaa gtttttgttt ttgtaaatct
7321 cgaagtatac tcaaacgaat ttagtatttt ctcagtgatc tcccagatgc tttcaccctc
7381 acttagaagt gctttaagca tttttttact gtggctattt cccttatctg cttcttccga
7441 tgattcgaac tgtaattgca aactacttac aatatcagtg atatcagatt gatgtttttg
7501 tccatagtaa ggaataattg taaattccca agcaggaatc aatttcttta atgaggcttc
7561 cagaattgtt gctttttgcg tcttgtattt aaactggagt gatttattga caatatcgaa
7621 actcagcgaa ttgcttatga tagtattata gctcatgaat gtggctctct tgattgctgt
7681 tccgttatgt gtaatcatcc aacataaata ggttagttca gcagcacata atgctatttt
7741 ctcacctgaa ggtctttcaa acctttccac aaactgacga acaagcacct taggtggtgt
7801 tttacataat atatcaaatt gtggcataca acctccttag tacatgcaac cattatcacc
7861 gccagaggta aaatagtcaa cacgcacggt gttagatatt tatcccttgc ggtgatagat
7921 ttaacgtatg agcacaaaaa agaaaccatt aacacaagag cagcttgagg acgcacgtcg
7981 ccttaaagca atttatgaaa aaaagaaaaa tgaacttggc ttatcccagg aatctgtcgc
8041 agacaagatg gggatggggc agtcaggcgt tggtgcttta tttaatggca tcaatgcatt
8101 aaatgcttat aacgccgcat tgcttacaaa aattctcaaa gttagcgttg aagaatttag
8161 cccttcaatc gccagagaaa tctacgagat gtatgaagcg gttagtatgc agccgtcact
8221 tagaagtgag tatgagtacc ctgttttttc tcatgttcag gcagggatgt tctcacctaa
8281 gcttagaacc tttaccaaag gtgatgcgga gagatgggta agcacaacca aaaaagccag
8341 tgattctgca ttctggcttg aggttgaagg taattccatg accgcaccaa caggctccaa
8401 gccaagcttt cctgacggaa tgttaattct cgttgaccct gagcaggctg ttgagccagg
8461 tgatttctgc atagccagac ttgggggtga tgagtttacc ttcaagaaac tgatcaggga
8521 tagcggtcag gtgtttttac aaccactaaa cccacagtac ccaatgatcc catgcaatga
8581 gagttgttcc gttgtgggga aagttatcgc tagtcagtgg cctgaagaga cgtttggctg
8641 atcggcaagg tgttctggtc ggcgcatagc tgataacaat tgagcaagaa tctgcatttc
8701 tttccagact tgttcaacag gccagccatt acgctcgtca tcaaaatcac tcgcatcaac
8761 caaaccgtta ttcattcgtg attgcgcctg agcgagacga aatacgcgat cgctgttaaa
8821 aggacaatta caaacaggaa tcgaatgcaa ccggcgcagg aacactgcca gcgcatcaac
8881 aatattttca cctgaatcag gatattcttc taatacctgg aatgctgttt tcccggggat
8941 cgcagtggtg agtaaccatg catcatcagg agtacggata aaatgcttga tggtcggaag
9001 aggcataaat tccgtcagcc agtttagtct gaccatctca tctgtaacat cattggcaac
9061 gctacctttg ccatgtttca gaaacaactc tggcgcatcg ggcttcccat acaatcgata
9121 gattgtcgca cctgattgcc cgacattatc gcgagcccat ttatacccat ataaatcagc
9181 atccatgttg gaatttaatc gcggcctcga gcaagacgtt tcccgttgaa tatggctcat
9241 aacacccctt gtattactgt ttatgtaagc agacagtttt attgttcatg atgatatatt
9301 tttatcttgt gcaatgtaac atcagagatt tt
//
质粒菌株产品操作说明书
一、扩增流程
收到产品后，请先根据产品管壁标签来判断产品形式，并在扩增前准确查找该质粒菌株的抗性、感受态和培养温度。
1、质粒干粉（常温运输，存于-20度，90天保质期，请务必转化挑单克隆培养，不要直接使用和测序）
①收到质粒干粉后请先5000rpm离心1min，再加入20μl ddH2O去离子水溶解质粒；
②取1支100μl 感受态于冰上解冻10min，加入2μl质粒，再冰浴30min后，42℃热激60s，不要搅动，再冰浴2min；（从第二步开始均要在超净工作台中无菌操作）
③加入900μl无抗的LB液体培养基，180rpm震荡37℃培养45min；
④6000rpm离心5min，仅留100μl上清液重悬细菌沉淀，并涂布至目标质粒抗性的LB平板上；（可使用本平台的平板涂布专用玻璃珠进行涂布，可以比传统涂布方法获得更多转化子）
⑤将平板正向培养1h，再倒置37℃培养14h。如果要求是30度则培养20h；
（菌落过多则将质粒稀释后再转化。没有菌落则加入10μl质粒转化。另不要直接转表达感受态，要先转克隆感受态，重提质粒后再导入表达感受态）
⑥挑取单菌落至LB液体培养基中，加入对应抗生素，220rpm震荡培养14h，根据实验需要和质粒提取试剂盒说明书提取质粒。
2、甘油菌种（冰袋运输，存于-80℃，保质期90天，请务必划线挑单克隆培养）
四区划线后挑单菌落培养，酵母菌需要先液体复苏再四区划线，再挑单菌落液体培养。
3、穿刺菌种（冰袋运输，存于4℃，保质期7天）
穿刺接种，液体培养后四区划线，再挑单菌落液体培养。
4、菌落平板（冰袋运输，存于4℃，保质期7天）
直接挑取单菌落至液体培养基中。
5、液体质粒（冰袋运输，存于-20℃，保质期90天）
单独提取的液体质粒收到后可直接使用。
6、滤纸质粒（常温运输，存于-20度，90天保质期，请务必转化挑单克隆培养，不要直接使用和测序）
收到货后将滤纸画圈部分剪下放入EP管中，加100ul无菌水将滤纸浸湿并浸泡5min，吸取5ul质粒转化，离心全涂。
二、转化图片
名称：pCP20大肠敲除质粒菌种
别称: pCP20
| 复制子: | pSC101 |
|---|---|
| 质粒分类: | 大肠系列质粒；大肠编辑质粒；大肠Red质粒 |
| 质粒大小: | 9332bp |
| 原核抗性: | Amp,Chl |
| 克隆菌株: | DH5a |
| 培养条件: | 30度 |
| 5'测序引物: | FLP-R（GAGCTTTGTTGTAGGTGGACC） |
| 3'测序引物: | FLP-F（TTGATGCGCTGGCAGTGTTC） |
质粒属性
| 载体宿主： | 大肠杆菌 |
|---|---|
| 载体用途： | 基因敲除 |
| 基因种属： | |
| 基因类型： | Red |
| 原核抗性： | Amp,Chl |
| 真核抗性： | |
| 荧光蛋白： |
pCP20是一种氨苄青霉素和CmR质粒，显示了FLP合成的温度敏感复制和热诱导。 用pCP20转化CmR和KmR突变体，在30℃下选择氨苄青霉素抗性转化体，之后在43℃选择性地纯化一些，然后测试所有抗生素抗性的损失。 大多数同时失去了FRT侧翼抗性基因和FLP辅助质粒。
质粒图谱
质粒序列
LOCUS Exported 9332 bp ds-DNA circular SYN 27-JUN-2017
DEFINITION synthetic circular DNA
KEYWORDS pCP20
SOURCE synthetic DNA construct
ORGANISM synthetic DNA construct
REFERENCE 1 (bases 1 to 9332)
TITLE Direct Submission
JOURNAL Exported Tuesday, June 27, 2017 from MiaoLingPlasmid
http://www.miaolingbio.com
FEATURES Location/Qualifiers
source 1..9332
/organism="synthetic DNA construct"
/mol_type="other DNA"
CDS complement(561..1220)
/codon_start=1
/gene="cat"
/product="chloramphenicol acetyltransferase"
/note="CmR"
/note="confers resistance to chloramphenicol"
/translation="MEKKITGYTTVDISQWHRKEHFEAFQSVAQCTYNQTVQLDITAFL
KTVKKNKHKFYPAFIHILARLMNAHPEFRMAMKDGELVIWDSVHPCYTVFHEQTETFSS
LWSEYHDDFRQFLHIYSQDVACYGENLAYFPKGFIENMFFVSANPWVSFTSFDLNVANM
DNFFAPVFTMGKYYTQGDKVLMPLAIQVHHAVCDGFHVGRMLNELQQYCDEWQGGA"
promoter complement(1221..1323)
/note="cat promoter"
/note="promoter of the E. coli cat gene encoding
chloramphenicol acetyltransferase"
rep_origin 1875..2097
/note="pSC101 ori"
/note="low-copy replication origin that requires the Rep101
protein"
CDS 2145..3095
/codon_start=1
/gene="rep101 encoding an A56V mutation"
/product="temperature-sensitive version of a protein needed
for replication with the pSC101 origin"
/note="Rep101(Ts)"
/translation="MSELVVFKANELAISRYDLTEHETKLILCCVALLNPTIENPTRKE
RTVSFTYNQYVQMMNISRENAYGVLAKATRELMTRTVEIRNPLVKGFEIFQWTNYAKFS
SEKLELVFSEEILPYLFQLKKFIKYNLEHVKSFENKYSMRIYEWLLKELTQKKTHKANI
EISLDEFKFMLMLENNYHEFKRLNQWVLKPISKDLNTYSNMKLVVDKRGRPTDTLIFQV
ELDRQMDLVTELENNQIKMNGDKIPTTITSDSYLHNGLRKTLHDALTAKIQLTSFEAKF
L-SDMQSKYDLNGSFSWLTQKQRTTLENILAKYGRI"
CDS complement(4557..5417)
/codon_start=1
/gene="bla"
/product="beta-lactamase"
/note="AmpR"
/note="confers resistance to ampicillin, carbenicillin, and
related antibiotics"
/translation="MSIQHFRVALIPFFAAFCLPVFAHPETLVKVKDAEDQLGARVGYI
ELDLNSGKILESFRPEERFPMMSTFKVLLCGAVLSRVDAGQEQLGRRIHYSQNDLVEYS
PVTEKHLTDGMTVRELCSAAITMSDNTAANLLLTTIGGPKELTAFLHNMGDHVTRLDRW
EPELNEAIPNDERDTTMPAAMATTLRKLLTGELLTLASRQQLIDWMEADKVAGPLLRSA
LPAGWFIADKSGAGERGSRGIIAALGPDGKPSRIVVIYTTGSQATMDERNRQIAEIGAS
LIKHW"
promoter complement(5418..5522)
/gene="bla"
/note="AmpR promoter"
CDS complement(6556..7827)
/codon_start=1
/product="site-specific recombinase"
/note="FLP"
/note="FLP is a site-specific recombinase from
Saccharomyces cerevisiae. Recombination occurs at FRT
sequences."
/translation="MPQFDILCKTPPKVLVRQFVERFERPSGEKIALCAAELTYLCWMI
THNGTAIKRATFMSYNTIISNSLSFDIVNKSLQFKYKTQKATILEASLKKLIPAWEFTI
IPYYGQKHQSDITDIVSSLQLQFESSEEADKGNSHSKKMLKALLSEGESIWEITEKILN
SFEYTSRFTKTKTLYQFLFLATFINCGRFSDIKNVDPKSFKLVQNKYLGVIIQCLVTET
KTSVSRHIYFFSARGRIDPLVYLDEFLRNSEPVLKRVNRTGNSSSNKQEYQLLKDNLVR
SYNKALKKNAPYSIFAIKNGPKSHIGRHLMTSFLSMKGLTELTNVVGNWSDKRASAVAR
TTYTHQITAIPDHYFALVSRYYAYDPISKEMIALKDETNPIEEWQHIEQLKGSAEGSIR
YPAWNGIISQEVLDYLSSYINRRI"
CDS 7928..8641
/codon_start=1
/gene="cIts"
/product="temperature-sensitive variant of the phage lambda
repressor"
/note="lambda repressor (ts)"
/note="thermosensitivity is conferred by the A67T mutation"
/translation="MSTKKKPLTQEQLEDARRLKAIYEKKKNELGLSQESVADKMGMGQ
SGVGALFNGINALNAYNAALLTKILKVSVEEFSPSIAREIYEMYEAVSMQPSLRSEYEY
PVFSHVQAGMFSPKLRTFTKGDAERWVSTTKKASDSAFWLEVEGNSMTAPTGSKPSFPD
GMLILVDPEQAVEPGDFCIARLGGDEFTFKKLIRDSGQVFLQPLNPQYPMIPCNESCSV
VGKVIASQWPEETFG"
ORIGIN
1 gagacacaac gtggctttgt tgaataaatc gaacttttgc tgagttgaag gatcagatca
61 cgcatcttcc cgacaacgca gaccgttccg tggcaaagca aaagttcaaa atcaccaact
121 ggtccaccta caacaaagct ctcatcaacc gtggctccct cactttctgg ctggatgatg
181 gggcgattca ggcctggtat gagtcagcaa caccttcttc acgaggcaga cctcagcgcc
241 acaggtgcgg ttgctggcgc taaccgtttt tatcaggctc tgggaggcag aataaatgat
301 catatcgtca attattacct ccacggggag agcctgagca aactggcctc aggcatttga
361 gaagcacacg gtcacactgc ttccggtagt caataaaccg gtaaaccagc aatagacata
421 agcggctatt taacgaccct gccctgaacc gacgaccggg tcgaatttgc tttcgaattt
481 ctgccattca tccgcttatt atcacttatt caggcgtagc aaccaggcgt ttaagggcac
541 caataactgc cttaaaaaaa ttacgccccg ccctgccact catcgcagta ctgttgtaat
601 tcattaagca ttctgccgac atggaagcca tcacaaacgg catgatgaac ctgaatcgcc
661 agcggcatca gcaccttgtc gccttgcgta taatatttgc ccatggtgaa aacgggggcg
721 aagaagttgt ccatattggc cacgtttaaa tcaaaactgg tgaaactcac ccagggattg
781 gctgagacga aaaacatatt ctcaataaac cctttaggga aataggccag gttttcaccg
841 taacacgcca catcttgcga atatatgtgt agaaactgcc ggaaatcgtc gtggtattca
901 ctccagagcg atgaaaacgt ttcagtttgc tcatggaaaa cggtgtaaca agggtgaaca
961 ctatcccata tcaccagctc accgtctttc attgccatac ggaattccgg atgagcattc
1021 atcaggcggg caagaatgtg aataaaggcc ggataaaact tgtgcttatt tttctttacg
1081 gtctttaaaa aggccgtaat atccagctga acggtctggt tataggtaca ttgagcaact
1141 gactgaaatg cctcaaaatg ttctttacga tgccattggg atatatcaac ggtggtatat
1201 ccagtgattt ttttctccat tttagcttcc ttagctcctg aaaatctcga taactcaaaa
1261 aatacgcccg gtagtgatct tatttcatta tggtgaaagt tggaacctct tacgtgccga
1321 tcaacgtctc attttcgcca aaagttggcc cagggcttcc cggtatcaac agggacacca
1381 ggatttattt attctgcgaa gtgatcttcc gtcacaggta tttattcggc gcaaagtgcg
1441 tcgggtgatg ctgccaactt actgatttag tgtatgatgg tgtttttgag gtgctccagt
1501 ggcttctgtt tctatcagct gtccctcctg ttcagctact gacggggtgg tgcgtaacgg
1561 caaaagcacc gccggacatc agcgcttgtt tcggcgtggg tatggtggca ggccccgtgg
1621 ccgggggact gttgggcgcc tgtagtgcca tttaccccca ttcactgcca gagccgtgag
1681 cgcagcgaac tgaatgtcac gaaaaagaca gcgactcagg tgcctgatgg tcggagacaa
1741 aaggaatatt cagcgatttg cccgagcttg cgagggtgct acttaagcct ttagggtttt
1801 aaggtctgtt ttgtagagga gcaaacagcg tttgcgacat ccttttgtaa tactgcggaa
1861 ctgactaaag tagtgagtta tacacagggc tgggatctat tctttttatc tttttttatt
1921 ctttctttat tctataaatt ataaccactt gaatataaac aaaaaaaaca cacaaaggtc
1981 tagcggaatt tacagagggt ctagcagaat ttacaagttt tccagcaaag gtctagcaga
2041 atttacagat acccacaact caaaggaaaa ggactagtaa ttatcattga ctagcccatc
2101 tcaattggta tagtgattaa aatcacctag accaattgag atgtatgtct gaattagttg
2161 ttttcaaagc aaatgaacta gcgattagtc gctatgactt aacggagcat gaaaccaagc
2221 taattttatg ctgtgtggca ctactcaacc ccacgattga aaaccctaca aggaaagaac
2281 ggacggtatc gttcacttat aaccaatacg ttcagatgat gaacatcagt agggaaaatg
2341 cttatggtgt attagctaaa gcaaccagag agctgatgac gagaactgtg gaaatcagga
2401 atcctttggt taaaggcttt gagattttcc agtggacaaa ctatgccaag ttctcaagcg
2461 aaaaattaga attagttttt agtgaagaga tattgcctta tcttttccag ttaaaaaaat
2521 tcataaaata taatctggaa catgttaagt cttttgaaaa caaatactct atgaggattt
2581 atgagtggtt attaaaagaa ctaacacaaa agaaaactca caaggcaaat atagagatta
2641 gccttgatga atttaagttc atgttaatgc ttgaaaataa ctaccatgag tttaaaaggc
2701 ttaaccaatg ggttttgaaa ccaataagta aagatttaaa cacttacagc aatatgaaat
2761 tggtggttga taagcgaggc cgcccgactg atacgttgat tttccaagtt gaactagata
2821 gacaaatgga tctcgtaacc gaacttgaga acaaccagat aaaaatgaat ggtgacaaaa
2881 taccaacaac cattacatca gattcctacc tacataacgg actaagaaaa acactacacg
2941 atgctttaac tgcaaaaatt cagctcacca gttttgaggc aaaatttttg agtgacatgc
3001 aaagtaagta tgatctcaat ggttcgttct catggctcac gcaaaaacaa cgaaccacac
3061 tagagaacat actggctaaa tacggaagga tctgaggttc ttatggctct tgtatctatc
3121 agtgaagcat caagactaac aaacaaaagt agaacaactg ttcaccgtta catatcaaag
3181 ggaaaactgt ccatatgcac agatgaaaac ggtgtaaaaa agatagatac atcagagctt
3241 ttacgagttt ttggtgcatt taaagctgtt caccatgaac agatcgacaa tgtaacagat
3301 gaacagcatg taacacctaa tagaacaggt gaaaccagta aaacaaagca actagaacat
3361 gaaattgaac acctgagaca acttgttaca gctcaacagt cacacataga cagcctgaaa
3421 caggcgatgc tgcttatcga atcaaagctg ccgacaacac gggagccagt gacgcctccc
3481 gtggggaaaa aatcatggca attctggaag aaatagcgcc tgtttcgttt caggcaggtt
3541 atcagggagt gtcagcgtcc tgcggttctc cggggcgttc gggtcatgca gcccgtaatg
3601 gtgatttacc agcgtctgcc aggcatcaat tctaggcctg tctgcgcggt cgtagtacgg
3661 ctggaggcgt tttccggtct gtagctccat gttcggaatg acaaaattca gctcaagccg
3721 tcccttgtcc tggtgctcca cccacaggat gctgtactga tttttttcga gaccgggcat
3781 cagtacacgc tcaaagctcg ccatcacttt ttcacgtcct cccggcggca gctccttctc
3841 cgcgaacgac agaacaccgg acgtgtattt cttcgcaaat ggcgtggcat cgatgagttc
3901 ccggacttct tccggattac cctgaagcac cgttgcgcct tcgcggttac gctccctccc
3961 cagcaggtaa tcaaccggac cactgccacc accttttccc ctggcatgaa atttaactat
4021 catcccgcgc cccctgttcc ctgacagcca gacgcagccg gcgcagctca tccccgatgg
4081 ccatcagtgc ggccaccacc tgaacccggt caccggaaga ccactgcccg ctgttcacct
4141 tacgggctgt ctgattcagg ttatttccga tggcggccag ctgacgcagt aacggcggtg
4201 ccagtgtcgg cagttttccg gaacgggcaa ccggctcccc caggcagacc cgccgcatcc
4261 ataccgccag ttgtttaccc tcacagcgtt caagtaaccg ggcatgttca tcatcagtaa
4321 cccgtattgt gagcatcctc tcgcgtttca tcggtatcat taccccatga acagaaatcc
4381 cccttacacg gaggcatcag tgactaaacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca
4441 cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat
4501 taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacagttac
4561 caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt
4621 gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc tggccccagt
4681 gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca ccggctccag atttatcagc aataaaccag
4741 ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc catccagtct
4801 attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt
4861 gttgccattg ctgcaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc
4921 tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt
4981 agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg
5041 gttatggcag cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg
5101 actggtgagt actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct
5161 tgcccggcgt caacacggga taataccgcg ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc
5221 attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt
5281 tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt
5341 tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg
5401 aaatgttgaa tactcatact cttccttttt caatattatt gaagcattta tcagggttat
5461 tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg
5521 cgcacatttc cccgaaaagt gccacctgac gtctaagaaa ccattattat catgacatta
5581 acctataaaa ataggcgtat cacgaggccc tttcgtcttc aagaatttta taaaccgtgg
5641 agcgggcaat actgagctga tgagcaattt ccgttgcacc agtgcccttc tgatgaagcg
5701 tcagcacgac gttcctgtcc acggtacgcc tgcggccaaa tttgattcct ttcagctttg
5761 cttcctgtcg gccctcattc gtgcgctcta ggatcctcta cgccggacgc atcgtggccg
5821 gcatcaccgg cgctgaggtc tgcctcgtga agaaggtgtt gctgactcat accaggcctg
5881 aatcgcccca tcatccagcc agaaagtgag ggagccacgg ttgatgagag ctttgttgta
5941 ggtggaccag ttggtgattt tgaacttttg ctttgccacg gaacggtctg cgttgtcggg
6001 aagatgcgtg atctgatcct tcaactcagc aaaagttcga tttattcaac aaagccgccg
6061 tcccgtcaag tcagcgtaat gctctgccag tgttacaacc aattaaccaa ttctgattag
6121 aaaaactcat cgagcatcaa atgaaactgc aatttattca tatcaggatt atcaatacca
6181 tatttttgaa aaagccgttt ctgtaatgaa ggagaaaact caccgaggca gttccatagg
6241 atggcaagat cctggtatcg gtctgcgatt ccgactcgtc caacatcaat acaacctatt
6301 aatttcccct cgtcaaaaat aaggttatca agtgagaaat caccatgagt gacgactgaa
6361 tccggtgaga atggcagaat aggaacttcg gaataggaac ttcaaagcgt ttccgaaaac
6421 gagcgcttcc gaaaatgcaa cgcgagctgc gcacatacag ctcactgttc acgtcgcacc
6481 tatatctgcg tgttgcctgt atatatatat acatgagaag aacggcatag tgcgtgttta
6541 tgcttaaatg cgtacttata tgcgtctatt tatgtaggat gaaaggtagt ctagtacctc
6601 ctgtgatatt atcccattcc atgcggggta tcgtatgctt ccttcagcac taccctttag
6661 ctgttctata tgctgccact cctcaattgg attagtctca tccttcaatg ctatcatttc
6721 ctttgatatt ggatcatatg catagtaccg agaaactagt gcgaagtagt gatcaggtat
6781 tgctgttatc tgatgagtat acgttgtcct ggccacggca gaagcacgct tatcgctcca
6841 atttcccaca acattagtca actccgttag gcccttcatt gaaagaaatg aggtcatcaa
6901 atgtcttcca atgtgagatt ttgggccatt ttttatagca aagattgaat aaggcgcatt
6961 tttcttcaaa gctttattgt acgatctgac taagttatct tttaataatt ggtattcctg
7021 tttattgctt gaagaattgc cggtcctatt tactcgtttt aggactggtt cagaattcct
7081 caaaaattca tccaaatata caagtggatc gatcctaccc cttgcgctaa agaagtatat
7141 gtgcctacta acgcttgtct ttgtctctgt cactaaacac tggattatta ctcccagata
7201 cttattttgg actaatttaa atgatttcgg atcaacgttc ttaatatcgc tgaatcttcc
7261 acaattgatg aaagtagcta ggaagaggaa ttggtataaa gtttttgttt ttgtaaatct
7321 cgaagtatac tcaaacgaat ttagtatttt ctcagtgatc tcccagatgc tttcaccctc
7381 acttagaagt gctttaagca tttttttact gtggctattt cccttatctg cttcttccga
7441 tgattcgaac tgtaattgca aactacttac aatatcagtg atatcagatt gatgtttttg
7501 tccatagtaa ggaataattg taaattccca agcaggaatc aatttcttta atgaggcttc
7561 cagaattgtt gctttttgcg tcttgtattt aaactggagt gatttattga caatatcgaa
7621 actcagcgaa ttgcttatga tagtattata gctcatgaat gtggctctct tgattgctgt
7681 tccgttatgt gtaatcatcc aacataaata ggttagttca gcagcacata atgctatttt
7741 ctcacctgaa ggtctttcaa acctttccac aaactgacga acaagcacct taggtggtgt
7801 tttacataat atatcaaatt gtggcataca acctccttag tacatgcaac cattatcacc
7861 gccagaggta aaatagtcaa cacgcacggt gttagatatt tatcccttgc ggtgatagat
7921 ttaacgtatg agcacaaaaa agaaaccatt aacacaagag cagcttgagg acgcacgtcg
7981 ccttaaagca atttatgaaa aaaagaaaaa tgaacttggc ttatcccagg aatctgtcgc
8041 agacaagatg gggatggggc agtcaggcgt tggtgcttta tttaatggca tcaatgcatt
8101 aaatgcttat aacgccgcat tgcttacaaa aattctcaaa gttagcgttg aagaatttag
8161 cccttcaatc gccagagaaa tctacgagat gtatgaagcg gttagtatgc agccgtcact
8221 tagaagtgag tatgagtacc ctgttttttc tcatgttcag gcagggatgt tctcacctaa
8281 gcttagaacc tttaccaaag gtgatgcgga gagatgggta agcacaacca aaaaagccag
8341 tgattctgca ttctggcttg aggttgaagg taattccatg accgcaccaa caggctccaa
8401 gccaagcttt cctgacggaa tgttaattct cgttgaccct gagcaggctg ttgagccagg
8461 tgatttctgc atagccagac ttgggggtga tgagtttacc ttcaagaaac tgatcaggga
8521 tagcggtcag gtgtttttac aaccactaaa cccacagtac ccaatgatcc catgcaatga
8581 gagttgttcc gttgtgggga aagttatcgc tagtcagtgg cctgaagaga cgtttggctg
8641 atcggcaagg tgttctggtc ggcgcatagc tgataacaat tgagcaagaa tctgcatttc
8701 tttccagact tgttcaacag gccagccatt acgctcgtca tcaaaatcac tcgcatcaac
8761 caaaccgtta ttcattcgtg attgcgcctg agcgagacga aatacgcgat cgctgttaaa
8821 aggacaatta caaacaggaa tcgaatgcaa ccggcgcagg aacactgcca gcgcatcaac
8881 aatattttca cctgaatcag gatattcttc taatacctgg aatgctgttt tcccggggat
8941 cgcagtggtg agtaaccatg catcatcagg agtacggata aaatgcttga tggtcggaag
9001 aggcataaat tccgtcagcc agtttagtct gaccatctca tctgtaacat cattggcaac
9061 gctacctttg ccatgtttca gaaacaactc tggcgcatcg ggcttcccat acaatcgata
9121 gattgtcgca cctgattgcc cgacattatc gcgagcccat ttatacccat ataaatcagc
9181 atccatgttg gaatttaatc gcggcctcga gcaagacgtt tcccgttgaa tatggctcat
9241 aacacccctt gtattactgt ttatgtaagc agacagtttt attgttcatg atgatatatt
9301 tttatcttgt gcaatgtaac atcagagatt tt
//
质粒菌株产品操作说明书
一、扩增流程
收到产品后，请先根据产品管壁标签来判断产品形式，并在扩增前准确查找该质粒菌株的抗性、感受态和培养温度。
1、质粒干粉（常温运输，存于-20度，90天保质期，请务必转化挑单克隆培养，不要直接使用和测序）
①收到质粒干粉后请先5000rpm离心1min，再加入20μl ddH2O去离子水溶解质粒；
②取1支100μl 感受态于冰上解冻10min，加入2μl质粒，再冰浴30min后，42℃热激60s，不要搅动，再冰浴2min；（从第二步开始均要在超净工作台中无菌操作）
③加入900μl无抗的LB液体培养基，180rpm震荡37℃培养45min；
④6000rpm离心5min，仅留100μl上清液重悬细菌沉淀，并涂布至目标质粒抗性的LB平板上；（可使用本平台的平板涂布专用玻璃珠进行涂布，可以比传统涂布方法获得更多转化子）
⑤将平板正向培养1h，再倒置37℃培养14h。如果要求是30度则培养20h；
（菌落过多则将质粒稀释后再转化。没有菌落则加入10μl质粒转化。另不要直接转表达感受态，要先转克隆感受态，重提质粒后再导入表达感受态）
⑥挑取单菌落至LB液体培养基中，加入对应抗生素，220rpm震荡培养14h，根据实验需要和质粒提取试剂盒说明书提取质粒。
2、甘油菌种（冰袋运输，存于-80℃，保质期90天，请务必划线挑单克隆培养）
四区划线后挑单菌落培养，酵母菌需要先液体复苏再四区划线，再挑单菌落液体培养。
3、穿刺菌种（冰袋运输，存于4℃，保质期7天）
穿刺接种，液体培养后四区划线，再挑单菌落液体培养。
4、菌落平板（冰袋运输，存于4℃，保质期7天）
直接挑取单菌落至液体培养基中。
5、液体质粒（冰袋运输，存于-20℃，保质期90天）
单独提取的液体质粒收到后可直接使用。
6、滤纸质粒（常温运输，存于-20度，90天保质期，请务必转化挑单克隆培养，不要直接使用和测序）
收到货后将滤纸画圈部分剪下放入EP管中，加100ul无菌水将滤纸浸湿并浸泡5min，吸取5ul质粒转化，离心全涂。
二、转化图片
| P0189/pT2-Venus哺乳转座质粒 |
| P1802/pPB-CAG-empty-pgk-hph哺乳转座质粒 |
| P2499/pPB-US-ECasE哺乳转座质粒 |
| P4859/pSBbi-GN哺乳转座质粒 |
| P0418/pCGlobin2-Cre同源重组质粒 |
| P0732/STOP-eGFP-ROSA26TV同源重组质粒 |
| P0733/pMC-CRE同源重组质粒 |
| P0734/pCAG-Cre:GFP同源重组质粒 |
| P0883/pBHGlox(delta)E13Cre腺病毒包装质粒 |
| P0926/pCAG-FlpeERT2同源重组质粒 |
| P1340/AAV pEF1a-DIO-FLPo-WPRE-hGHpA同源重组质粒 |
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文献和实验相关实验
明书的操作步骤操作以确保残留的 Rinse B 被甩干。 7.为什么提出的质粒的多是二聚体和多聚体形式？ 是在质粒复制过程中形成的，与宿主菌相关，电泳可检测出。 8.质粒为何会丢失？ 细菌培养不要超过 16 小时，否则细菌会崩溃，引起细菌大量死亡，导致质粒丢失。有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。因此不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。另外，检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。 9. 大肠杆菌老化： 请涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养。 10
1. 琼脂糖凝胶电泳检测质粒为何有三条条带 通常完整的质粒电泳会看到多个电泳条带，这与质粒的多种形态有关。质粒可以有超螺旋，线性，开环等多种不同的形态，所以在电泳时常看到三条不同大小的条带，而最下面最亮的条带一般为超螺旋条带。 左图为电镜下的质粒形态，可以看到质粒有不同程度的超螺旋形态；右图为质粒电泳图 2. 质粒纯度不好 质粒中常见的污染杂质有蛋白质、基因组 DNA、RNA、乙醇等。这些杂质有可能是质粒提取过程中操作不当有关，比如： ①在加入裂解缓冲液后，剧烈震荡导致大肠杆菌基因
上有较大差异，因此同时设计构建 2～3 个靶点的基因敲除载体再从中选出敲减效果较佳的靶点。N1-N20 NGG 靠近 PAM 的碱基对靶点的特异性很重要，前 7～12 个碱基的错配对 Cas9 切割效率影响较小。设计好的靶点序列应在基因库中进行 BLAST 检测。Cas9Nicknase 需要挑选成对的靶点。一般在正义链和反义链上分别挑选相距 20～30bp 的靶点配对。多对靶点的敲除效率常有较大差异。由于基因敲除实验时间长，在正式对目的细胞进行敲除前对靶点进行验证和挑选非常必要。二、 插入
pCP20大肠敲除质粒菌种
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