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- 2025年10月14日
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继和生物
正常血清/正常血清/正常血清的要求
1．掌握一般培养基制备的原则和要求。
2．熟悉一般培养基制备的过程。
操作步骤
一、培养基的制备原则和要求
培养基是根据各类微生物生长繁殖的需要，用人工方法把多种物质混合而成的营养物。一般用来分离、培养菌类。常用的培养基有基础培养基、增菌培养基、选择培养基、鉴别培养基和厌氧培养基。在制备培养基时，应掌握如下原则和要求：
（一）培养基必须含有细菌生长繁殖所需要的营养物质。所用的化学药品必须纯净，称取的份量务必准确。
（二）培养基的酸碱度应符合细菌生长要求。按各种培养基要求准确测定调节pH值。多数细菌生长的适宜pH值为7.2～7.6，呈弱碱性。
（三）培养基的灭菌时间和温度，应按照各种培养基的规定进行，以保证灭菌效果及不损失培养基的必需营养成分。培养基经灭菌后，必须置37℃温箱中培养24小时，无菌方可应用。
（四）所用器皿须洁净，忌用铁或钢质器皿，要求没有抑制细菌生长的物质存在。
（五）制成的培养基应该是透明的，以便观察细菌生长性状以及其他代谢活动所产生的变化。
二、培养基制备过程
不同的培养基其制备方法也不同，一般包括以下步骤：
（一）准确称量 试剂 根据不同的菌类和用途，选择适宜的培养基，培养基所需 试剂 必须纯净。
（二）校正pH值 将称量好的培养基各种成分放入容器内，标记划线，加热溶解，补充水分，测定酸碱度，常用pH6.8～8.0的精密试纸或酸度计测定。用1N NaOH和1N HCl调节pH值到适宜范围内。
（三）过滤 将玻璃漏斗置铁架上，再用纱布夹棉花或用滤纸放在漏斗中，将上述培养基倒入其中过滤至透明。
（四）分装 将过滤后的培养基分装于中试管或三角瓶内（试管内每支装5mL；三角瓶中装100～150ml），塞好棉塞用牛皮纸包扎好，准备灭菌。
（五）灭菌 培养基的灭菌，常用高压蒸汽灭菌法。一般微 生物 的营养细胞在水中煮沸后即被杀死，但细菌的芽胞有较强的抗热性，须经高压蒸汽灭菌才能达到彻底灭菌的目的。根据蒸汽温度随压力升高而上升的原理，即压力越大，蒸汽温度就越高。因此，在同一温度条件下，采用高压蒸汽灭菌比干热灭菌法效果要好。而且在湿热情况下，菌体吸收水分后，其蛋白质易于凝固变性，因为蒸汽的穿透力强，杀菌效果好。
高压蒸汽灭菌，一般采用15磅／平方（即1.05kg／cm2）压力，此时的温度是121.3℃。灭菌20～30分钟后，可达到完全灭菌的目的。在进行灭菌的时候，首先要把灭菌锅内的冷空气排出，否则，冷空气存在会降低锅内的实际温度，影响灭菌效果。
三、基础培养基的制备
（一）牛肉浸液（肉水）
1．成分 新鲜牛肉 500g ，水1000 ml。
2．制法
（1）取新鲜牛肉，剔除肌膜、脂肪，切成小块，用绞肉机绞碎。
（2）按上述比例加水，浸泡过夜（夏天应将浸泡液放置在低温的地方，防止腐败；如果没有冷藏条件时，可省去浸泡过夜这一步），其间应搅拌数次。
（3）次日取上液煮沸一小时，并不断搅拌。
（4）补足蒸发的水分，用白布或绒布过滤后分装于三角瓶中，准备灭菌。
（5）置高压灭菌器内，15磅灭菌20～30分钟，置低温、暗处保存备用。正常人血清/正常人血清/正常人血清用途
用于制备各种培养基的基础液。
（二）肉浸液肉汤（普通肉汤）
1．成分 肉水 1000 ml ，蛋白胨 10g，氯化钠 5g，磷酸氢二钾 2g。
2．制法
（1）将以上成份加温溶于牛肉浸液中。
（2）调pH值为7.4～7.6。
（3）滤纸过滤后分装。
（4）15磅20～30分钟灭菌后备用。
3．用途 作一般细菌培养用。
（三）营养琼脂培养基（普通琼脂）
1．成分 肉水 1000ml，蛋白胨10g，磷酸氢二钾 lg ，氯化钠 5g，琼脂 20g。
2．制法
（1）将上述成分混合后，加热溶解，补足水份。
（2）校正pH值7.4～7.6。
（3）用纱布夹棉花过滤。
（4）分装于中 试管 或三角瓶中。
（5）高压灭菌20～30分钟后，将中 试管 摆成斜面，保存备用。
3．用途 一般细菌分离培养、菌种保存或用作特殊培养基。
（四）半固体培养基 基本上与营养 琼脂 的制备相同，仅将 琼脂 量减少至0.5～0.7％（1000 ml中加5～7g琼脂）即可。
（五）鲜血琼脂 将灭菌的营养琼脂加热溶化，冷却至45～50℃时，加入5～8％无菌脱纤鲜血（绵羊、黄牛、马和兔等），分装于 试管 后立即摆成斜面、或倾注于平皿中，待凝固后，置37℃培养1～2日。有污染者废弃；无菌者保存，置冰箱备用。
无菌脱纤维鲜血的制备：以无菌操作采取动物鲜血（绵羊、黄牛、马从颈静脉采血；兔则从心脏采血），放入带玻璃珠的无菌三角瓶内，摇动5～10分钟，放冰箱中备用。
红细胞（erythrocyte，red blood cell）直径7～8.5μm，呈双凹圆盘状，中央较薄（1.0μm），周缘较厚（2.0μm），故在血涂片标本中呈中央染色较浅、周缘较深（彩图5－2）。在扫描电镜下，可清楚地显示红细胞这种形态特点（图5－3）。红细胞的这种形态使它具有较大的表面积（约140μm 2 ），从而能最大限度地适应其功能携O 2 和CO 2 。新鲜单个红细胞为黄绿色，大量红细胞使血液呈猩红色，而且多个红细胞常叠连一起呈串钱状，称红细胞缗线。
图5-2 各种血细胞 1.2.3.单核细胞 4.5.6.淋巴细胞 7.8.9.10.11.中性粒细胞
12.13.14.嗜酸性粒细胞 15.嗜酸性粒细胞 16.红细胞 17.血小板.
图5－3 人红细胞扫描电镜像 ×4800
红细胞有一定的弹性和可塑性，细胞通过毛细血管时可改变形状。红细胞正常形态的保持需ATP供给能量，由于红细胞缺乏线粒体，ATP由无氧酵解产生；一量缺乏ATP供能，则导致细胞膜结构改变，细胞的形态也随之由圆盘状变为棘球状。这种形态改变一般是可逆的。可随着ATP的供能状态的改善而恢复。
成熟红细胞无细胞核，也无细胞器,胞质内充满血红蛋白（hemoglobin,Hb）。血红蛋白是含铁的蛋白质，约占红细胞重量的33％。它具有结合与运输O 2 和CO 2 的功能，当血液流经肺时，肺内的O 2 分压高，CO 2 分压低，血红蛋白即放出CO 2 而与O 2 结合；当血液流经其它器官的组织时，由于该处的CO 2 分压高而O 2 分压低，于是红细胞即放出O 2 并结合CO 2 。由于血红蛋白具有这种性质，所以红细胞能供给全身组织和细胞所需的O 2 ，带走所产生的部分CO 2 。
正常成人每微升血液中红细胞数的平均值，男性约400万～500万个，女性约350万～450万个。每100ml血液中血红蛋白含量，男性约12～15g，女性约10.5～13.5g。全身所有红细胞表面积总计，相当于人体表面积的2000倍 。红细胞的数目及血红蛋白的含量可有生理性改变，如婴儿高于成人，运动时多于安静状态，高原地区居民大都高于平原地区居民，红细胞的形态和数目的改变、以及血红蛋白的质和量的改变超出正常范围，则表现为病理现象。一般说，红细胞数少于300万／μ1，血红蛋白低于10g/100ml,则为 贫血 。此时常伴有红细胞的直径及形态的改变，如大红细胞贫血的红细胞平均直径>9μm，小红细胞贫血的红细胞平均直径<6μm。缺铁性贫血的红细胞，由于血红蛋白的含量明显降低，以致中央淡染区明显扩大。
正常人血清/正常人血清/正常人血清红细胞的渗透压与血浆相等，使出入红细胞的水分维持平衡。当血浆渗透压降低时，过量水分进入细胞，细胞膨胀成球形，甚至破裂，血红蛋白逸出，称为溶血（hemolysis）；溶血后残留的红细胞膜囊称为血影（ghost）。反之，若血浆的渗透压升高，可使红细胞内的水分析出过多，致使红细胞皱缩。凡能损害红细胞的因素，如脂溶剂、蛇毒、溶血性细菌等均能引起溶血。
红细胞的细胞膜，除具有一般细胞膜的共性外，还有其特殊性，例如红细胞膜上有ABO血型抗原。
外周血中除大量成熟红细胞以外，还有少量未完全成熟的红细胞，称为网织红细胞（reticulocyte）在成人约为红细胞总数的0.5％～1.5％，新生儿较多，可达3％～6％。网织红细胞的直径略大于成熟红细胞，在常规染色的血涂片中不能与成熟红细胞区分。用煌焦蓝作体外活体染色，可见网织红细胞的胞质内有染成蓝色的细网或颗粒，它是细胞内残留的核糖体。核糖体的存在，表明网织红细胞仍有一些合成血红蛋白的功能。红细胞完全成熟时，核糖体消失,血红蛋白的含量即不再增加。贫血病人如果造血功能良好，其血液中网织红细胞的百分比值增高。因此，网织红细胞的计数有一定临床意义，它是贫血等某些血液病的诊断、疗效判断和估计预指标之一。
红细胞的平均寿命约120天。 衰老 的红细胞虽无形态上的特殊樗，但其机能活动和理化性质都有变化，如酶活性降低，血红蛋白变性，细胞膜脆性增大，以及表面电荷改变等，因而细胞与氧结合的能力降低且容易破碎。衰老的红细胞多在脾、骨髓和肝等处被巨噬细胞吞噬，同时由红骨髓生成和释放同等数量红细胞进入外周血液，维持红细胞数的相对恒定。
1．掌握一般培养基制备的原则和要求。
2．熟悉一般培养基制备的过程。
操作步骤
一、培养基的制备原则和要求
培养基是根据各类微生物生长繁殖的需要，用人工方法把多种物质混合而成的营养物。一般用来分离、培养菌类。常用的培养基有基础培养基、增菌培养基、选择培养基、鉴别培养基和厌氧培养基。在制备培养基时，应掌握如下原则和要求：
（一）培养基必须含有细菌生长繁殖所需要的营养物质。所用的化学药品必须纯净，称取的份量务必准确。
（二）培养基的酸碱度应符合细菌生长要求。按各种培养基要求准确测定调节pH值。多数细菌生长的适宜pH值为7.2～7.6，呈弱碱性。
（三）培养基的灭菌时间和温度，应按照各种培养基的规定进行，以保证灭菌效果及不损失培养基的必需营养成分。培养基经灭菌后，必须置37℃温箱中培养24小时，无菌方可应用。
（四）所用器皿须洁净，忌用铁或钢质器皿，要求没有抑制细菌生长的物质存在。
（五）制成的培养基应该是透明的，以便观察细菌生长性状以及其他代谢活动所产生的变化。
二、培养基制备过程
不同的培养基其制备方法也不同，一般包括以下步骤：
（一）准确称量 试剂 根据不同的菌类和用途，选择适宜的培养基，培养基所需 试剂 必须纯净。
（二）校正pH值 将称量好的培养基各种成分放入容器内，标记划线，加热溶解，补充水分，测定酸碱度，常用pH6.8～8.0的精密试纸或酸度计测定。用1N NaOH和1N HCl调节pH值到适宜范围内。
（三）过滤 将玻璃漏斗置铁架上，再用纱布夹棉花或用滤纸放在漏斗中，将上述培养基倒入其中过滤至透明。
（四）分装 将过滤后的培养基分装于中试管或三角瓶内（试管内每支装5mL；三角瓶中装100～150ml），塞好棉塞用牛皮纸包扎好，准备灭菌。
（五）灭菌 培养基的灭菌，常用高压蒸汽灭菌法。一般微 生物 的营养细胞在水中煮沸后即被杀死，但细菌的芽胞有较强的抗热性，须经高压蒸汽灭菌才能达到彻底灭菌的目的。根据蒸汽温度随压力升高而上升的原理，即压力越大，蒸汽温度就越高。因此，在同一温度条件下，采用高压蒸汽灭菌比干热灭菌法效果要好。而且在湿热情况下，菌体吸收水分后，其蛋白质易于凝固变性，因为蒸汽的穿透力强，杀菌效果好。
高压蒸汽灭菌，一般采用15磅／平方（即1.05kg／cm2）压力，此时的温度是121.3℃。灭菌20～30分钟后，可达到完全灭菌的目的。在进行灭菌的时候，首先要把灭菌锅内的冷空气排出，否则，冷空气存在会降低锅内的实际温度，影响灭菌效果。
三、基础培养基的制备
（一）牛肉浸液（肉水）
1．成分 新鲜牛肉 500g ，水1000 ml。
2．制法
（1）取新鲜牛肉，剔除肌膜、脂肪，切成小块，用绞肉机绞碎。
（2）按上述比例加水，浸泡过夜（夏天应将浸泡液放置在低温的地方，防止腐败；如果没有冷藏条件时，可省去浸泡过夜这一步），其间应搅拌数次。
（3）次日取上液煮沸一小时，并不断搅拌。
（4）补足蒸发的水分，用白布或绒布过滤后分装于三角瓶中，准备灭菌。
（5）置高压灭菌器内，15磅灭菌20～30分钟，置低温、暗处保存备用。正常人血清/正常人血清/正常人血清用途
用于制备各种培养基的基础液。
（二）肉浸液肉汤（普通肉汤）
1．成分 肉水 1000 ml ，蛋白胨 10g，氯化钠 5g，磷酸氢二钾 2g。
2．制法
（1）将以上成份加温溶于牛肉浸液中。
（2）调pH值为7.4～7.6。
（3）滤纸过滤后分装。
（4）15磅20～30分钟灭菌后备用。
3．用途 作一般细菌培养用。
（三）营养琼脂培养基（普通琼脂）
1．成分 肉水 1000ml，蛋白胨10g，磷酸氢二钾 lg ，氯化钠 5g，琼脂 20g。
2．制法
（1）将上述成分混合后，加热溶解，补足水份。
（2）校正pH值7.4～7.6。
（3）用纱布夹棉花过滤。
（4）分装于中 试管 或三角瓶中。
（5）高压灭菌20～30分钟后，将中 试管 摆成斜面，保存备用。
3．用途 一般细菌分离培养、菌种保存或用作特殊培养基。
（四）半固体培养基 基本上与营养 琼脂 的制备相同，仅将 琼脂 量减少至0.5～0.7％（1000 ml中加5～7g琼脂）即可。
（五）鲜血琼脂 将灭菌的营养琼脂加热溶化，冷却至45～50℃时，加入5～8％无菌脱纤鲜血（绵羊、黄牛、马和兔等），分装于 试管 后立即摆成斜面、或倾注于平皿中，待凝固后，置37℃培养1～2日。有污染者废弃；无菌者保存，置冰箱备用。
无菌脱纤维鲜血的制备：以无菌操作采取动物鲜血（绵羊、黄牛、马从颈静脉采血；兔则从心脏采血），放入带玻璃珠的无菌三角瓶内，摇动5～10分钟，放冰箱中备用。
红细胞（erythrocyte，red blood cell）直径7～8.5μm，呈双凹圆盘状，中央较薄（1.0μm），周缘较厚（2.0μm），故在血涂片标本中呈中央染色较浅、周缘较深（彩图5－2）。在扫描电镜下，可清楚地显示红细胞这种形态特点（图5－3）。红细胞的这种形态使它具有较大的表面积（约140μm 2 ），从而能最大限度地适应其功能携O 2 和CO 2 。新鲜单个红细胞为黄绿色，大量红细胞使血液呈猩红色，而且多个红细胞常叠连一起呈串钱状，称红细胞缗线。
图5-2 各种血细胞 1.2.3.单核细胞 4.5.6.淋巴细胞 7.8.9.10.11.中性粒细胞
12.13.14.嗜酸性粒细胞 15.嗜酸性粒细胞 16.红细胞 17.血小板.
图5－3 人红细胞扫描电镜像 ×4800
红细胞有一定的弹性和可塑性，细胞通过毛细血管时可改变形状。红细胞正常形态的保持需ATP供给能量，由于红细胞缺乏线粒体，ATP由无氧酵解产生；一量缺乏ATP供能，则导致细胞膜结构改变，细胞的形态也随之由圆盘状变为棘球状。这种形态改变一般是可逆的。可随着ATP的供能状态的改善而恢复。
成熟红细胞无细胞核，也无细胞器,胞质内充满血红蛋白（hemoglobin,Hb）。血红蛋白是含铁的蛋白质，约占红细胞重量的33％。它具有结合与运输O 2 和CO 2 的功能，当血液流经肺时，肺内的O 2 分压高，CO 2 分压低，血红蛋白即放出CO 2 而与O 2 结合；当血液流经其它器官的组织时，由于该处的CO 2 分压高而O 2 分压低，于是红细胞即放出O 2 并结合CO 2 。由于血红蛋白具有这种性质，所以红细胞能供给全身组织和细胞所需的O 2 ，带走所产生的部分CO 2 。
正常成人每微升血液中红细胞数的平均值，男性约400万～500万个，女性约350万～450万个。每100ml血液中血红蛋白含量，男性约12～15g，女性约10.5～13.5g。全身所有红细胞表面积总计，相当于人体表面积的2000倍 。红细胞的数目及血红蛋白的含量可有生理性改变，如婴儿高于成人，运动时多于安静状态，高原地区居民大都高于平原地区居民，红细胞的形态和数目的改变、以及血红蛋白的质和量的改变超出正常范围，则表现为病理现象。一般说，红细胞数少于300万／μ1，血红蛋白低于10g/100ml,则为 贫血 。此时常伴有红细胞的直径及形态的改变，如大红细胞贫血的红细胞平均直径>9μm，小红细胞贫血的红细胞平均直径<6μm。缺铁性贫血的红细胞，由于血红蛋白的含量明显降低，以致中央淡染区明显扩大。
正常人血清/正常人血清/正常人血清红细胞的渗透压与血浆相等，使出入红细胞的水分维持平衡。当血浆渗透压降低时，过量水分进入细胞，细胞膨胀成球形，甚至破裂，血红蛋白逸出，称为溶血（hemolysis）；溶血后残留的红细胞膜囊称为血影（ghost）。反之，若血浆的渗透压升高，可使红细胞内的水分析出过多，致使红细胞皱缩。凡能损害红细胞的因素，如脂溶剂、蛇毒、溶血性细菌等均能引起溶血。
红细胞的细胞膜，除具有一般细胞膜的共性外，还有其特殊性，例如红细胞膜上有ABO血型抗原。
外周血中除大量成熟红细胞以外，还有少量未完全成熟的红细胞，称为网织红细胞（reticulocyte）在成人约为红细胞总数的0.5％～1.5％，新生儿较多，可达3％～6％。网织红细胞的直径略大于成熟红细胞，在常规染色的血涂片中不能与成熟红细胞区分。用煌焦蓝作体外活体染色，可见网织红细胞的胞质内有染成蓝色的细网或颗粒，它是细胞内残留的核糖体。核糖体的存在，表明网织红细胞仍有一些合成血红蛋白的功能。红细胞完全成熟时，核糖体消失,血红蛋白的含量即不再增加。贫血病人如果造血功能良好，其血液中网织红细胞的百分比值增高。因此，网织红细胞的计数有一定临床意义，它是贫血等某些血液病的诊断、疗效判断和估计预指标之一。
红细胞的平均寿命约120天。 衰老 的红细胞虽无形态上的特殊樗，但其机能活动和理化性质都有变化，如酶活性降低，血红蛋白变性，细胞膜脆性增大，以及表面电荷改变等，因而细胞与氧结合的能力降低且容易破碎。衰老的红细胞多在脾、骨髓和肝等处被巨噬细胞吞噬，同时由红骨髓生成和释放同等数量红细胞进入外周血液，维持红细胞数的相对恒定。
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