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- 上海
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- 2025年07月11日
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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
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-20
- 保质期：
2年
- 英文名：
pET14b
- 库存：
100
- 供应商：
上海烜雅生物科技有限公司
- 规格：
干粉/液体
基本信息
名称：pET-14b大肠表达质粒
别称: pET14b
质粒属性
质粒简介
The pET-14b vector carries an N-terminal His•Tag® sequence followed by a thrombin site and three cloning sites. Unique sites are shown on the circle map. Note that thesequence is numbered by the pBR322 convention, so the T7 expression region is reversed on the circular map. The cloning/expression region of the coding strand transcribed by T7 RNA polymerase is shown below.
质粒图谱
质粒序列
LOCUS Exported 4671 bp ds-DNA circular SYN 30-7-2015
DEFINITION synthetic circular DNA
ACCESSION .
VERSION .
KEYWORDS Untitled
SOURCE synthetic DNA construct
ORGANISM synthetic DNA construct
REFERENCE 1 (bases 1 to 4671)
AUTHORS .
TITLE Direct Submission
JOURNAL Exported 2015-7-30 from MLCC
http://www.miaolingbio.com
FEATURES Location/Qualifiers
source 1..4671
/organism="synthetic DNA construct"
/mol_type="other DNA"
source 590..612
/organism="Enterobacteria phage T7"
/mol_type="genomic DNA"
/db_xref="taxon:10760"
promoter 10..38
/note="tet promoter"
/note="E. coli promoter for tetracycline efflux protein
gene"
terminator 404..451
/note="T7 terminator"
/note="transcription terminator for bacteriophage T7 RNA
polymerase"
CDS complement(527..544)
/codon_start=1
/product="thrombin recognition and cleavage site"
/note="thrombin site"
/translation="LVPRGS"
CDS complement(554..571)
/codon_start=1
/product="6xHis affinity tag"
/note="6xHis"
/translation="HHHHHH"
RBS 590..612
/note="efficient ribosome binding site from bacteriophage
T7 gene 10 (Olins and Rangwala, 1989)"
promoter complement(644..662)
/note="T7 promoter"
/note="promoter for bacteriophage T7 RNA polymerase"
CDS 2223..2414
/codon_start=1
/gene="rop"
/product="Rop protein, which maintains plasmids at low copy
number"
/note="rop"
/translation="MTKQEKTALNMARFIRSQTLTLLEKLNELDADEQADICESLHDHA
DELYRSCLARFGDDGENL"
misc_feature 2516..2658
/note="bom"
/note="basis of mobility region from pBR322"
rep_origin complement(2844..3432)
/direction=LEFT
/note="ori"
/note="high-copy-number ColE1/pMB1/pBR322/pUC origin of
replication"
CDS complement(3603..4463)
/codon_start=1
/gene="bla"
/product="beta-lactamase"
/note="AmpR"
/note="confers resistance to ampicillin, carbenicillin, and
related antibiotics"
/translation="MSIQHFRVALIPFFAAFCLPVFAHPETLVKVKDAEDQLGARVGYI
ELDLNSGKILESFRPEERFPMMSTFKVLLCGAVLSRVDAGQEQLGRRIHYSQNDLVEYS
PVTEKHLTDGMTVRELCSAAITMSDNTAANLLLTTIGGPKELTAFLHNMGDHVTRLDRW
EPELNEAIPNDERDTTMPAAMATTLRKLLTGELLTLASRQQLIDWMEADKVAGPLLRSA
LPAGWFIADKSGAGERGSRGIIAALGPDGKPSRIVVIYTTGSQATMDERNRQIAEIGAS
LIKHW"
promoter complement(4464..4568)
/gene="bla"
/note="AmpR promoter"
ORIGIN
1 ttctcatgtt tgacagctta tcatcgataa gctttaatgc ggtagtttat cacagttaaa
61 ttgctaacgc agtcaggcac cgtgtatgaa atctaacaat gcgctcatcg tcatcctcgg
121 caccgtcacc ctggatgctg taggcatagg cttggttatg ccggtactgc cgggcctctt
181 gcgggatatc gtccattccg acagcatcgc cagtcactat ggcgtgctgc tagcgctata
241 tgcgttgatg caatttctat gcgcacccgt tctcggagca ctgtccgacc gctttggccg
301 ccgcccagtc ctgctcgctt cgctacttgg agccactatc gactacgcga tcatggcgac
361 cacacccgtc ctgtggatat ccggatatag ttcctccttt cagcaaaaaa cccctcaaga
421 cccgtttaga ggccccaagg ggttatgcta gttattgctc agcggtggca gcagccaact
481 cagcttcctt tcgggctttg ttagcagccg gatcctcgag catatggctg ccgcgcggca
541 ccaggccgct gctgtgatga tgatgatgat ggctgctgcc catggtatat ctccttctta
601 aagttaaaca aaattatttc tagagggaaa ccgttgtggt ctccctatag tgagtcgtat
661 taatttcgcg ggatcgagat ctcgatcctc tacgccggac gcatcgtggc cggcatcacc
721 ggcgccacag gtgcggttgc tggcgcctat atcgccgaca tcaccgatgg ggaagatcgg
781 gctcgccact tcgggctcat gagcgcttgt ttcggcgtgg gtatggtggc aggccccgtg
841 gccgggggac tgttgggcgc catctccttg catgcaccat tccttgcggc ggcggtgctc
901 aacggcctca acctactact gggctgcttc ctaatgcagg agtcgcataa gggagagcgt
961 cgaccgatgc ccttgagagc cttcaaccca gtcagctcct tccggtgggc gcggggcatg
1021 actatcgtcg ccgcacttat gactgtcttc tttatcatgc aactcgtagg acaggtgccg
1081 gcagcgctct gggtcatttt cggcgaggac cgctttcgct ggagcgcgac gatgatcggc
1141 ctgtcgcttg cggtattcgg aatcttgcac gccctcgctc aagccttcgt cactggtccc
1201 gccaccaaac gtttcggcga gaagcaggcc attatcgccg gcatggcggc cgacgcgctg
1261 ggctacgtct tgctggcgtt cgcgacgcga ggctggatgg ccttccccat tatgattctt
1321 ctcgcttccg gcggcatcgg gatgcccgcg ttgcaggcca tgctgtccag gcaggtagat
1381 gacgaccatc agggacagct tcaaggatcg ctcgcggctc ttaccagcct aacttcgatc
1441 actggaccgc tgatcgtcac ggcgatttat gccgcctcgg cgagcacatg gaacgggttg
1501 gcatggattg taggcgccgc cctatacctt gtctgcctcc ccgcgttgcg tcgcggtgca
1561 tggagccggg ccacctcgac ctgaatggaa gccggcggca cctcgctaac ggattcacca
1621 ctccaagaat tggagccaat caattcttgc ggagaactgt gaatgcgcaa accaaccctt
1681 ggcagaacat atccatcgcg tccgccatct ccagcagccg cacgcggcgc atctcgggca
1741 gcgttgggtc ctggccacgg gtgcgcatga tcgtgctcct gtcgttgagg acccggctag
1801 gctggcgggg ttgccttact ggttagcaga atgaatcacc gatacgcgag cgaacgtgaa
1861 gcgactgctg ctgcaaaacg tctgcgacct gagcaacaac atgaatggtc ttcggtttcc
1921 gtgtttcgta aagtctggaa acgcggaagt cagcgccctg caccattatg ttccggatct
1981 gcatcgcagg atgctgctgg ctaccctgtg gaacacctac atctgtatta acgaagcgct
2041 ggcattgacc ctgagtgatt tttctctggt cccgccgcat ccataccgcc agttgtttac
2101 cctcacaacg ttccagtaac cgggcatgtt catcatcagt aacccgtatc gtgagcatcc
2161 tctctcgttt catcggtatc attaccccca tgaacagaaa tcccccttac acggaggcat
2221 cagtgaccaa acaggaaaaa accgccctta acatggcccg ctttatcaga agccagacat
2281 taacgcttct ggagaaactc aacgagctgg acgcggatga acaggcagac atctgtgaat
2341 cgcttcacga ccacgctgat gagctttacc gcagctgcct cgcgcgtttc ggtgatgacg
2401 gtgaaaacct ctgacacatg cagctcccgg agacggtcac agcttgtctg taagcggatg
2461 ccgggagcag acaagcccgt cagggcgcgt cagcgggtgt tggcgggtgt cggggcgcag
2521 ccatgaccca gtcacgtagc gatagcggag tgtatactgg cttaactatg cggcatcaga
2581 gcagattgta ctgagagtgc accatatatg cggtgtgaaa taccgcacag atgcgtaagg
2641 agaaaatacc gcatcaggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc
2701 gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa
2761 tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt
2821 aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa
2881 aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt
2941 ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg
3001 tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc
3061 agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc
3121 gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta
3181 tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct
3241 acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaaggacagt atttggtatc
3301 tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa
3361 caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa
3421 aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa
3481 aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt
3541 ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac
3601 agttaccaat gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc
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4261 ctcatcattg gaaaacgttc ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga
4321 tccagttcga tgtaacccac tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt tactttcacc
4381 agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg
4441 acacggaaat gttgaatact catactcttc ctttttcaat attattgaag catttatcag
4501 ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg
4561 gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca cctgacgtct aagaaaccat tattatcatg
4621 acattaacct ataaaaatag gcgtatcacg aggccctttc gtcttcaaga a
//
质粒菌株产品操作说明书
一、扩增流程
收到产品后，请先根据产品管壁标签来判断产品形式，并在扩增前准确查找该质粒菌株的抗性、感受态和培养温度。
1、质粒干粉（常温运输，存于-20度，90天保质期，请务必转化挑单克隆培养，不要直接使用和测序）
①收到质粒干粉后请先5000rpm离心1min，再加入20μl ddH2O去离子水溶解质粒；
②取1支100μl 感受态于冰上解冻10min，加入2μl质粒，再冰浴30min后，42℃热激60s，不要搅动，再冰浴2min；（从第二步开始均要在超净工作台中无菌操作）
③加入900μl无抗的LB液体培养基，180rpm震荡37℃培养45min；
④6000rpm离心5min，仅留100μl上清液重悬细菌沉淀，并涂布至目标质粒抗性的LB平板上；（可使用本平台的平板涂布专用玻璃珠进行涂布，可以比传统涂布方法获得更多转化子）
⑤将平板正向培养1h，再倒置37℃培养14h。如果要求是30度则培养20h；
（菌落过多则将质粒稀释后再转化。没有菌落则加入10μl质粒转化。另不要直接转表达感受态，要先转克隆感受态，重提质粒后再导入表达感受态）
⑥挑取单菌落至LB液体培养基中，加入对应抗生素，220rpm震荡培养14h，根据实验需要和质粒提取试剂盒说明书提取质粒。
2、甘油菌种（冰袋运输，存于-80℃，保质期90天，请务必划线挑单克隆培养）
四区划线后挑单菌落培养，酵母菌需要先液体复苏再四区划线，再挑单菌落液体培养。
3、穿刺菌种（冰袋运输，存于4℃，保质期7天）
穿刺接种，液体培养后四区划线，再挑单菌落液体培养。
4、菌落平板（冰袋运输，存于4℃，保质期7天）
直接挑取单菌落至液体培养基中。
5、液体质粒（冰袋运输，存于-20℃，保质期90天）
单独提取的液体质粒收到后可直接使用。
6、滤纸质粒（常温运输，存于-20度，90天保质期，请务必转化挑单克隆培养，不要直接使用和测序）
收到货后将滤纸画圈部分剪下放入EP管中，加100ul无菌水将滤纸浸湿并浸泡5min，吸取5ul质粒转化，离心全涂。
二、转化图片
名称：pET-14b大肠表达质粒
别称: pET14b
| 启动子: | T7 |
|---|---|
| 复制子: | pBR322 |
| 终止子: | T7 terminator |
| 质粒分类: | 大肠杆菌载体；PET系列表达质粒 |
| 质粒大小: | 4671bp |
| 质粒标签: | N-His, N-thrombin |
| 原核抗性: | Amp |
| 克隆菌株: | DH5a |
| 培养条件: | 37度 |
| 表达宿主: | BL21(DE3) |
| 培养条件: | 37℃，有氧，LB |
| 诱导方式: | IPTG或乳糖及其类似物 |
| 5'测序引物: | T7:TAATACGACTCACTATAGGG |
| 3'测序引物: | T7-ter:TGCTAGTTATTGCTCAGCGG |
质粒属性
| 载体宿主： | 大肠杆菌 |
|---|---|
| 载体用途： | 蛋白表达 |
| 基因种属： | 空载体 |
| 基因类型： | ORF |
| 原核抗性： | Amp |
| 真核抗性： | |
| 荧光蛋白： |
质粒简介
The pET-14b vector carries an N-terminal His•Tag® sequence followed by a thrombin site and three cloning sites. Unique sites are shown on the circle map. Note that thesequence is numbered by the pBR322 convention, so the T7 expression region is reversed on the circular map. The cloning/expression region of the coding strand transcribed by T7 RNA polymerase is shown below.
质粒图谱
质粒序列
LOCUS Exported 4671 bp ds-DNA circular SYN 30-7-2015
DEFINITION synthetic circular DNA
ACCESSION .
VERSION .
KEYWORDS Untitled
SOURCE synthetic DNA construct
ORGANISM synthetic DNA construct
REFERENCE 1 (bases 1 to 4671)
AUTHORS .
TITLE Direct Submission
JOURNAL Exported 2015-7-30 from MLCC
http://www.miaolingbio.com
FEATURES Location/Qualifiers
source 1..4671
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/mol_type="other DNA"
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/note="E. coli promoter for tetracycline efflux protein
gene"
terminator 404..451
/note="T7 terminator"
/note="transcription terminator for bacteriophage T7 RNA
polymerase"
CDS complement(527..544)
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/note="thrombin site"
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CDS complement(554..571)
/codon_start=1
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/note="6xHis"
/translation="HHHHHH"
RBS 590..612
/note="efficient ribosome binding site from bacteriophage
T7 gene 10 (Olins and Rangwala, 1989)"
promoter complement(644..662)
/note="T7 promoter"
/note="promoter for bacteriophage T7 RNA polymerase"
CDS 2223..2414
/codon_start=1
/gene="rop"
/product="Rop protein, which maintains plasmids at low copy
number"
/note="rop"
/translation="MTKQEKTALNMARFIRSQTLTLLEKLNELDADEQADICESLHDHA
DELYRSCLARFGDDGENL"
misc_feature 2516..2658
/note="bom"
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/note="high-copy-number ColE1/pMB1/pBR322/pUC origin of
replication"
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/note="AmpR"
/note="confers resistance to ampicillin, carbenicillin, and
related antibiotics"
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ELDLNSGKILESFRPEERFPMMSTFKVLLCGAVLSRVDAGQEQLGRRIHYSQNDLVEYS
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ORIGIN
1 ttctcatgtt tgacagctta tcatcgataa gctttaatgc ggtagtttat cacagttaaa
61 ttgctaacgc agtcaggcac cgtgtatgaa atctaacaat gcgctcatcg tcatcctcgg
121 caccgtcacc ctggatgctg taggcatagg cttggttatg ccggtactgc cgggcctctt
181 gcgggatatc gtccattccg acagcatcgc cagtcactat ggcgtgctgc tagcgctata
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841 gccgggggac tgttgggcgc catctccttg catgcaccat tccttgcggc ggcggtgctc
901 aacggcctca acctactact gggctgcttc ctaatgcagg agtcgcataa gggagagcgt
961 cgaccgatgc ccttgagagc cttcaaccca gtcagctcct tccggtgggc gcggggcatg
1021 actatcgtcg ccgcacttat gactgtcttc tttatcatgc aactcgtagg acaggtgccg
1081 gcagcgctct gggtcatttt cggcgaggac cgctttcgct ggagcgcgac gatgatcggc
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3541 ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac
3601 agttaccaat gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc
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质粒菌株产品操作说明书
一、扩增流程
收到产品后，请先根据产品管壁标签来判断产品形式，并在扩增前准确查找该质粒菌株的抗性、感受态和培养温度。
1、质粒干粉（常温运输，存于-20度，90天保质期，请务必转化挑单克隆培养，不要直接使用和测序）
①收到质粒干粉后请先5000rpm离心1min，再加入20μl ddH2O去离子水溶解质粒；
②取1支100μl 感受态于冰上解冻10min，加入2μl质粒，再冰浴30min后，42℃热激60s，不要搅动，再冰浴2min；（从第二步开始均要在超净工作台中无菌操作）
③加入900μl无抗的LB液体培养基，180rpm震荡37℃培养45min；
④6000rpm离心5min，仅留100μl上清液重悬细菌沉淀，并涂布至目标质粒抗性的LB平板上；（可使用本平台的平板涂布专用玻璃珠进行涂布，可以比传统涂布方法获得更多转化子）
⑤将平板正向培养1h，再倒置37℃培养14h。如果要求是30度则培养20h；
（菌落过多则将质粒稀释后再转化。没有菌落则加入10μl质粒转化。另不要直接转表达感受态，要先转克隆感受态，重提质粒后再导入表达感受态）
⑥挑取单菌落至LB液体培养基中，加入对应抗生素，220rpm震荡培养14h，根据实验需要和质粒提取试剂盒说明书提取质粒。
2、甘油菌种（冰袋运输，存于-80℃，保质期90天，请务必划线挑单克隆培养）
四区划线后挑单菌落培养，酵母菌需要先液体复苏再四区划线，再挑单菌落液体培养。
3、穿刺菌种（冰袋运输，存于4℃，保质期7天）
穿刺接种，液体培养后四区划线，再挑单菌落液体培养。
4、菌落平板（冰袋运输，存于4℃，保质期7天）
直接挑取单菌落至液体培养基中。
5、液体质粒（冰袋运输，存于-20℃，保质期90天）
单独提取的液体质粒收到后可直接使用。
6、滤纸质粒（常温运输，存于-20度，90天保质期，请务必转化挑单克隆培养，不要直接使用和测序）
收到货后将滤纸画圈部分剪下放入EP管中，加100ul无菌水将滤纸浸湿并浸泡5min，吸取5ul质粒转化，离心全涂。
二、转化图片
| P2526/pENTR223-RPL36AL-T11C人源基因质粒 |
| P2527/pENTR223-SNX9-G267C人源基因质粒 |
| P2528/pENTR223-NDUFA5人源基因质粒 |
| P2529/pENTR223-NDUFV3人源基因质粒 |
| P2530/pENTR223-VAMP1-G13A人源基因质粒 |
| P2531/pENTR223-SUMO3人源基因质粒 |
| P2532/pENTR223-PLAC8人源基因质粒 |
| P2533/pENTR223-LOC116349人源基因质粒 |
| P2534/pENTR223-FILIP1L人源基因质粒 |
| P2535/pENTR223-KLHL14(1-1070bp)人源基因质粒 |
| P2536/pENTR223-CENPA人源基因质粒 |
| P2537/pENTR223-RBX1人源基因质粒 |
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文献和实验相关实验
晚上每天都有人做报告，我觉得让我收获最大的是Bill Studier的报告。本来这个报告是后来才听到的，但是由于Burgess的模块是唯一的涉及大肠杆菌中表达蛋白的，我把这一段提前来说说。Studier这老哥是Brookhaven National Laboratory的，一生研究T7噬菌体，也是T7 RNA polymerase induction system（pET系列质粒）的发明者。 T7系统在大肠杆菌表达蛋白的应用实在太广泛了，但凡表达蛋白的兄弟姐妹们的不可能不知道这个系统
-1,pBADHis, pBADHislacZ，pLLP ompA, pINIIIompA, pMBP-P ,pMBP-C 共表达质粒：pCDFduet-1 以及pCDNA3.1，pEGFP-N2等 大肠杆菌Rosetta（DE3），Rasettagame（DE3），Top10F', BL21(DE3)plySS 等 酵母表达质粒： pPICZαA, pGAPZαA, 酵母细胞 KM71, X33 yingzi
其分子间作用力呈显著下降趋势。 在计算机模拟和蛋白质分子设计的基础上，以野生型TFPI基因为模板，用PCR方法引入突变，构建表达质粒pET―28a(+)―TFPI―Mutl和pET―28a(+)―TFPI―Mut4。然后参照野生型TFPI的基因表达、蛋白质复性及纯化方式，用大肠杆菌制备重组的TFPI―Mutl和TFPI―Mut4。试验证实TFPI―Mutl和TFPI―Mut4保持了与TFPI基本相当的抗凝活性，而且半衰期较TFPl分别延长1．62和4．22倍。
pET-14b大肠表达质粒
￥100 - 1000
