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- Xybio
- 上海
- P3429
- 2026年05月03日
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- 文献和实验
- 技术资料
- 保存条件：
-20
- 保质期：
2年
- 英文名：
NM_010206.3;AW208770;bFGF-R-1;c-fgr;
- 库存：
100
- 供应商：
上海烜雅生物科技有限公司
- 规格：
干粉/液体
名称：pMD18-FGFR1-m（1同义突变）小鼠基因质粒
别称: NM_010206.3;AW208770;bFGF-R-1;c-fgr;
复制子: pUC
原核抗性: Amp
克隆菌株: DH5a
培养条件: 37度
质粒属性
载体宿主：大肠杆菌
载体用途：PCR模板
基因种属：小鼠
基因类型：cDNA
原核抗性：Amp
真核抗性：
荧光蛋白：
质粒简介
pMD18-FGFR1-m（1同义突变）小鼠基因质粒人源基因质粒
质粒图谱
质粒序列：详询
质粒菌株产品操作说明书
一、扩增流程
收到产品后，请先根据产品管壁标签来判断产品形式，并在扩增前准确查找该质粒菌株的抗性、感受态和培养温度。
1、质粒干粉（常温运输，存于-20度，90天保质期，请务必转化挑单克隆培养，不要直接使用和测序）
①收到质粒干粉后请先5000rpm离心1min，再加入20μl ddH2O去离子水溶解质粒；
②取1支100μl 感受态于冰上解冻10min，加入2μl质粒，再冰浴30min后，42℃热激60s，不要搅动，再冰浴2min；（从第二步开始均要在超净工作台中无菌操作）
③加入900μl无抗的LB液体培养基，180rpm震荡37℃培养45min；
④6000rpm离心5min，仅留100μl上清液重悬细菌沉淀，并涂布至目标质粒抗性的LB平板上；（可使用本平台的平板涂布专用玻璃珠进行涂布，可以比传统涂布方法获得更多转化子）
⑤将平板正向培养1h，再倒置37℃培养14h。如果要求是30度则培养20h；
（菌落过多则将质粒稀释后再转化。没有菌落则加入10μl质粒转化。另不要直接转表达感受态，要先转克隆感受态，重提质粒后再导入表达感受态）
⑥挑取单菌落至LB液体培养基中，加入对应抗生素，220rpm震荡培养14h，根据实验需要和质粒提取试剂盒说明书提取质粒。
2、甘油菌种（冰袋运输，存于-80℃，保质期90天，请务必划线挑单克隆培养）
四区划线后挑单菌落培养，酵母菌需要先液体复苏再四区划线，再挑单菌落液体培养。
3、穿刺菌种（冰袋运输，存于4℃，保质期7天）
穿刺接种，液体培养后四区划线，再挑单菌落液体培养。
4、菌落平板（冰袋运输，存于4℃，保质期7天）
直接挑取单菌落至液体培养基中。
5、液体质粒（冰袋运输，存于-20℃，保质期90天）
单独提取的液体质粒收到后可直接使用。
6、滤纸质粒（常温运输，存于-20度，90天保质期，请务必转化挑单克隆培养，不要直接使用和测序）
收到货后将滤纸画圈部分剪下放入EP管中，加100ul无菌水将滤纸浸湿并浸泡5min，吸取5ul质粒转化，离心全涂。
二、转化图片
| P3624/pCMV-SPORT6-SNAP25人源基因质粒 |
| P3625/pCMV-SPORT6-CRYZL1人源基因质粒 |
| P2803/pCMV-SPORT6-CHI3L1人源基因质粒 |
| P2090/pCMV-SPORT6-RWDD1人源基因质粒 |
| P3838/pCMV-SPORT6-ACTR3B人源基因质粒 |
| P3839/pCMV-SPORT6-MAP3K7CL人源基因质粒 |
| P3840/pCMV-SPORT6-DYM人源基因质粒 |
| P3841/pCMV-SPORT6-SLC41A3（1同义突变）人源基因质粒 |
| P3842/pCMV-SPORT6-NEUROD1人源基因质粒 |
| P3843/pCMV-SPORT6-PTPN11人源基因质粒 |
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文献和实验编码区的基因片段，其由5'末端的stat密码子（ATG）和3'末端的终止密码子（TAA，TAG或TGA）结合。然后将目的基因片段插入pMD18-T载体中以构建重组质粒，通过DNA测序鉴定。用指定的酶消化重组pMD18-T质粒，并通过以下方案将检索到的目的DNA片段亚克隆到pET-32α（+）载体中以产生重组表达载体。将约129bp的TBO基因片段插入pET-32α（+）载体（5900bp）用相同的限制酶在37℃消化pET-32α（+）载体和重组pMD18-T载体1小时，然后通过在65℃温育10分钟
模板没有同步改变 PAM 或 seed 区序列，HDR 成功后新生成的等位基因依然能被 Cas9 识别并再次切开。反复切—修—切的结果是：好不容易修复正确的克隆被切坏，最终留下来的反而是 indel 克隆。 对策：在供体模板上对 PAM 或 seed 区引入同义突变（不改变氨基酸序列），使修复后的位点无法被再次识别。这是敲入设计里的标准动作，也是最容易被漏掉的一步。 障碍 2：供体模板的随机整合 质粒供体（尤其是带抗性基因的）会随机整合到基因组其他位置。用抗性筛选后长出来的克隆，很大一部分是随机
培养基 2. X-gal（20mg/mL）将X-gal溶于二甲基甲酰胺，配成20mg/mL，不需要过滤灭菌，每份1mL分装，避光贮存于-20℃。 3. IPTG（200mg/mL）：取1g IPTG溶于5mL双蒸水，用0.22μm滤膜过滤除菌，每份1mL，贮存于-20℃。 4. 氨苄青霉素（Amp 100mg/mL） 5. pMD18-T Vector（TaKaRa连接试剂盒）
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