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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 保存条件:
-20
- 保质期:
2年
- 英文名:
MTQ2;HEMK2;N6AMT;PRED28;C21orf127
- 库存:
100
- 供应商:
上海烜雅生物科技有限公司
- 规格:
干粉/液体
名称:pLVML-3×FLAG-N6AMT1人源基因质粒
别称: MTQ2;HEMK2;N6AMT;PRED28;C21orf127
启动子:CMV
复制子: pUC
终止子: WPRE
原核抗性: Amp
筛选标记:Puro
克隆菌株: DH5a
培养条件: 37度
质粒属性
载体宿主:哺乳细胞
载体用途:蛋白表达
基因种属:人
基因类型:ORF
原核抗性:Amp
真核抗性:Puro
荧光蛋白:
质粒简介
pLVML-3×FLAG-N6AMT1-IRES-Puro(NM_013240.5)是一个人源基因慢病毒哺乳细胞过表达质粒。
质粒图谱
质粒序列
LOCUS Exported 8840 bp ds-DNA circular SYN 13-DEC-2017
DEFINITION synthetic circular DNA
FEATURES Location/Qualifiers
source 1..8840
/organism="synthetic DNA construct"
/mol_type="other DNA"
LTR 1..634
/label=3' LTR
/note="3' long terminal repeat (LTR) from HIV-1"
misc_feature 681..806
/label=HIV-1 Psi
/note="packaging signal of human immunodeficiency virus
type 1"
misc_feature 1303..1536
/label=RRE
/note="The Rev response element (RRE) of HIV-1 allows for
Rev-dependent mRNA export from the nucleus to the
cytoplasm."
misc_feature 2028..2143
/label=cPPT/CTS
/note="central polypurine tract and central termination
sequence of HIV-1 (lacking the first T)"
enhancer 2201..2504
/label=CMV enhancer
/note="human cytomegalovirus immediate early enhancer"
promoter 2505..2708
/label=CMV promoter
/note="human cytomegalovirus (CMV) immediate early
promoter"
regulatory 2809..2814
/regulatory_class="other"
/note="vertebrate consensus sequence for strong initiation
of translation (Kozak, 1987)"
CDS 2818..2883
/codon_start=1
/product="three tandem FLAG(R) epitope tags, followed by an
enterokinase cleavage site"
/label=3xFLAG
/translation="DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK"
CDS 2890..3534
/codon_start=1
/product="pLVML-3×FLAG-N6AMT1-IRES-Puro(NM_013240.5)"
/label=N6AMT1
/translation="MAGENFATPFHGHVGRGAFSDVYEPAEDTFLLLDALEAAAAELAG
VEICLEVGSGSGVVSAFLASMIGPQALYMCTDINPEAAACTLETARCNKVHIQPVITDL
VKGLLPRLTEKVDLLVFNPPYVVTPPQEVGSHGIEAAWAGGRNGREVMDRFFPLVPDLL
SPRGLFYLVTIKENNPEEILKIMKTKGLQGTTALSRQAGQETLSVLKFTKS"
misc_feature 3543..4116
/label=IRES
/note="internal ribosome entry site (IRES) of the
encephalomyocarditis virus (EMCV)"
CDS 4149..4748
/codon_start=1
/gene="pac from Streptomyces alboniger"
/product="puromycin N-acetyltransferase"
/label=PuroR
/note="confers resistance to puromycin"
/translation="MTEYKPTVRLATRDDVPRAVRTLAAAFADYPATRHTVDPDRHIER
VTELQELFLTRVGLDIGKVWVADDGAAVAVWTTPESVEAGAVFAEIGPRMAELSGSRLA
AQQQMEGLLAPHRPKEPAWFLATVGVSPDHQGKGLGSAVVLPGVEAAERAGVPAFLETS
APRNLPFYERLGFTVTADVEVPEGPRTWCMTRKPGA"
misc_feature 4762..5350
/label=WPRE
/note="woodchuck hepatitis virus posttranscriptional
regulatory element"
LTR 5557..6190
/label=3' LTR
/note="3' long terminal repeat (LTR) from HIV-1"
rep_origin complement(6720..7308)
/direction=LEFT
/label=ori
/note="high-copy-number ColE1/pMB1/pBR322/pUC origin of
replication"
CDS complement(7479..8339)
/codon_start=1
/gene="bla"
/product="beta-lactamase"
/label=AmpR
/note="confers resistance to ampicillin, carbenicillin, and
related antibiotics"
/translation="MSIQHFRVALIPFFAAFCLPVFAHPETLVKVKDAEDQLGARVGYI
ELDLNSGKILESFRPEERFPMMSTFKVLLCGAVLSRIDAGQEQLGRRIHYSQNDLVEYS
PVTEKHLTDGMTVRELCSAAITMSDNTAANLLLTTIGGPKELTAFLHNMGDHVTRLDRW
EPELNEAIPNDERDTTMPVAMATTLRKLLTGELLTLASRQQLIDWMEADKVAGPLLRSA
LPAGWFIADKSGAGERGSRGIIAALGPDGKPSRIVVIYTTGSQATMDERNRQIAEIGAS
LIKHW"
promoter complement(8340..8444)
/gene="bla"
/label=AmpR promoter
polyA_signal 8492..8626
/label=SV40 poly(A) signal
/note="SV40 polyadenylation signal"
ORIGIN
1 tggaagggct aattcactcc caaagaagac aagatatcct tgatctgtgg atctaccaca
61 cacaaggcta cttccctgat tagcagaact acacaccagg gccaggggtc agatatccac
121 tgacctttgg atggtgctac aagctagtac cagttgagcc agataaggta gaagaggcca
181 ataaaggaga gaacaccagc ttgttacacc ctgtgagcct gcatgggatg gatgacccgg
241 agagagaagt gttagagtgg aggtttgaca gccgcctagc atttcatcac gtggcccgag
301 agctgcatcc ggagtacttc aagaactgct gatatcgagc ttgctacaag ggactttccg
361 ctggggactt tccagggagg cgtggcctgg gcgggactgg ggagtggcga gccctcagat
421 cctgcatata agcagctgct ttttgcctgt actgggtctc tctggttaga ccagatctga
481 gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta agcctcaata aagcttgcct
541 tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact ctggtaacta gagatccctc
601 agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg cccgaacagg gacttgaaag
661 cgaaagggaa accagaggag ctctctcgac gcaggactcg gcttgctgaa gcgcgcacgg
721 caagaggcga ggggcggcga ctggtgagta cgccaaaaat tttgactagc ggaggctaga
781 aggagagaga tgggtgcgag agcgtcagta ttaagcgggg gagaattaga tcgcgatggg
841 aaaaaattcg gttaaggcca gggggaaaga aaaaatataa attaaaacat atagtatggg
901 caagcaggga gctagaacga ttcgcagtta atcctggcct gttagaaaca tcagaaggct
961 gtagacaaat actgggacag ctacaaccat cccttcagac aggatcagaa gaacttagat
1021 cattatataa tacagtagca accctctatt gtgtgcatca aaggatagag ataaaagaca
1081 ccaaggaagc tttagacaag atagaggaag agcaaaacaa aagtaagacc accgcacagc
1141 aagcggccgg ccgctgatct tcagacctgg aggaggagat atgagggaca attggagaag
1201 tgaattatat aaatataaag tagtaaaaat tgaaccatta ggagtagcac ccaccaaggc
1261 aaagagaaga gtggtgcaga gagaaaaaag agcagtggga ataggagctt tgttccttgg
1321 gttcttggga gcagcaggaa gcactatggg cgcagcgtca atgacgctga cggtacaggc
1381 cagacaatta ttgtctggta tagtgcagca gcagaacaat ttgctgaggg ctattgaggc
1441 gcaacagcat ctgttgcaac tcacagtctg gggcatcaag cagctccagg caagaatcct
1501 ggctgtggaa agatacctaa aggatcaaca gctcctgggg atttggggtt gctctggaaa
1561 actcatttgc accactgctg tgccttggaa tgctagttgg agtaataaat ctctggaaca
1621 gatttggaat cacacgacct ggatggagtg ggacagagaa attaacaatt acacaagctt
1681 aatacactcc ttaattgaag aatcgcaaaa ccagcaagaa aagaatgaac aagaattatt
1741 ggaattagat aaatgggcaa gtttgtggaa ttggtttaac ataacaaatt ggctgtggta
1801 tataaaatta ttcataatga tagtaggagg cttggtaggt ttaagaatag tttttgctgt
1861 actttctata gtgaatagag ttaggcaggg atattcacca ttatcgtttc agacccacct
1921 cccaaccccg aggggacccg acaggcccga aggaatagaa gaagaaggtg gagagagaga
1981 cagagacaga tccattcgat tagtgaacgg atctcgacgg tatcgccttt aaaagaaaag
2041 gggggattgg ggggtacagt gcaggggaaa gaatagtaga cataatagca acagacatac
2101 aaactaaaga attacaaaaa caaattacaa aaattcaaaa ttttcgggtt tattacaggg
2161 acagcagaga tccagtttat cgataagctt gggagttccg cgttacataa cttacggtaa
2221 atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg
2281 ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag tatttacggt
2341 aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg
2401 tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta tgggactttc
2461 ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac catggtgatg cggttttggc
2521 agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg atttccaagt ctccacccca
2581 ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta
2641 acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa
2701 gcagagctcg tttagtgaac cgtcagatcg cctggagacg ccatccacgc tgttttgacc
2761 tccatagaag acaccgactc tactagagga tctatttccg gtgaattcgc caccatggac
2821 tacaaagacc atgacggtga ttataaagat catgacatcg actacaagga tgacgatgac
2881 aagctcgaga tggcagggga gaacttcgct acgccgttcc acgggcacgt gggccgcggc
2941 gccttcagcg acgtgtacga gcccgcggag gacacgtttc tgcttttgga cgcgctggag
3001 gcagcggctg ccgaactggc aggagtggaa atatgcctgg aagtagggtc agggtctggt
3061 gtagtatctg cattcctagc ctctatgata ggccctcagg ctttgtacat gtgcactgat
3121 atcaaccctg aggcagcagc ttgtacccta gagacagcac gctgtaacaa agttcacatt
3181 caaccagtta ttacagattt ggtcaaaggc ttgctaccaa gattgaccga aaaagttgat
3241 cttctggtgt ttaatccccc ctatgtagtg actccacctc aagaggtagg aagtcacgga
3301 atagaggcag cttgggctgg tggcagaaat ggtcgggaag tcatggacag gttttttccc
3361 ctggttccag atctcctttc accaagagga ttattctatt tagttaccat taaagaaaac
3421 aacccagaag aaattttgaa aataatgaag acaaaaggtc tgcaaggaac cactgcactt
3481 tccagacaag caggccaaga aactctttca gtcctcaagt tcaccaagtc ttagggatcc
3541 cgcccctctc cctccccccc ccctaacgtt actggccgaa gccgcttgga ataaggccgg
3601 tgtgcgtttg tctatatgtt attttccacc atattgccgt cttttggcaa tgtgagggcc
3661 cggaaacctg gccctgtctt cttgacgagc attcctaggg gtctttcccc tctcgccaaa
3721 ggaatgcaag gtctgttgaa tgtcgtgaag gaagcagttc ctctggaagc ttcttgaaga
3781 caaacaacgt ctgtagcgac cctttgcagg cagcggaacc ccccacctgg cgacaggtgc
3841 ctctgcggcc aaaagccacg tgtataagat acacctgcaa aggcggcaca accccagtgc
3901 cacgttgtga gttggatagt tgtggaaaga gtcaaatggc tctcctcaag cgtattcaac
3961 aaggggctga aggatgccca gaaggtaccc cattgtatgg gatctgatct ggggcctcgg
4021 tgcacatgct ttacatgtgt ttagtcgagg ttaaaaaaac gtctaggccc cccgaaccac
4081 ggggacgtgg ttttcctttg aaaaacacga tgataagctt gccacaaccc acaaggagac
4141 gaccttccat gaccgagtac aagcccacgg tgcgcctcgc cacccgcgac gacgtccccc
4201 gggccgtacg caccctcgcc gccgcgttcg ccgactaccc cgccacgcgc cacaccgtcg
4261 acccggaccg ccacatcgag cgggtcaccg agctgcaaga actcttcctc acgcgcgtcg
4321 ggctcgacat cggcaaggtg tgggtcgcgg acgacggcgc cgcggtggcg gtctggacca
4381 cgccggagag cgtcgaagcg ggggcggtgt tcgccgagat cggcccgcgc atggccgagt
4441 tgagcggttc ccggctggcc gcgcagcaac agatggaagg cctcctggcg ccgcaccggc
4501 ccaaggagcc cgcgtggttc ctggccaccg tcggcgtctc gcccgaccac cagggcaagg
4561 gtctgggcag cgccgtcgtg ctccccggag tggaggcggc cgagcgcgcc ggggtgcccg
4621 ccttcctgga gacctccgcg ccccgcaacc tccccttcta cgagcggctc ggcttcaccg
4681 tcaccgccga cgtcgaggtg cccgaaggac cgcgcacctg gtgcatgacc cgcaagcccg
4741 gtgcctagac gcgtctggaa caatcaacct ctggattaca aaatttgtga aagattgact
4801 ggtattctta actatgttgc tccttttacg ctatgtggat acgctgcttt aatgcctttg
4861 tatcatgcta ttgcttcccg tatggctttc attttctcct ccttgtataa atcctggttg
4921 ctgtctcttt atgaggagtt gtggcccgtt gtcaggcaac gtggcgtggt gtgcactgtg
4981 tttgctgacg caacccccac tggttggggc attgccacca cctgtcagct cctttccggg
5041 actttcgctt tccccctccc tattgccacg gcggaactca tcgccgcctg ccttgcccgc
5101 tgctggacag gggctcggct gttgggcact gacaattccg tggtgttgtc ggggaagctg
5161 acgtcctttc catggctgct cgcctgtgtt gccacctgga ttctgcgcgg gacgtccttc
5221 tgctacgtcc cttcggccct caatccagcg gaccttcctt cccgcggcct gctgccggct
5281 ctgcggcctc ttccgcgtct tcgccttcgc cctcagacga gtcggatctc cctttgggcc
5341 gcctccccgc ctggaattaa ttctgcagtc gagacctaga aaaacatgga gcaatcacaa
5401 gtagcaatac agcagctacc aatgctgatt gtgcctggct agaagcacaa gaggaggagg
5461 aggtgggttt tccagtcaca cctcaggtac ctttaagacc aatgacttac aaggcagctg
5521 tagatcttag ccacttttta aaagaaaaga ggggactgga agggctaatt cactcccaac
5581 gaagacaaga tatccttgat ctgtggatct accacacaca aggctacttc cctgattagc
5641 agaactacac accagggcca ggggtcagat atccactgac ctttggatgg tgctacaagc
5701 tagtaccagt tgagccagat aaggtagaag aggccaataa aggagagaac accagcttgt
5761 tacaccctgt gagcctgcat gggatggatg acccggagag agaagtgtta gagtggaggt
5821 ttgacagccg cctagcattt catcacgtgg cccgagagct gcatccggag tacttcaaga
5881 actgctgata tcgagcttgc tacaagggac tttccgctgg ggactttcca gggaggcgtg
5941 gcctgggcgg gactggggag tggcgagccc tcagatcctg catataagca gctgcttttt
6001 gcctgtactg ggtctctctg gttagaccag atctgagcct gggagctctc tggctaacta
6061 gggaacccac tgcttaagcc tcaataaagc ttgccttgag tgcttcaagt agtgtgtgcc
6121 cgtctgttgt gtgactctgg taactagaga tccctcagac ccttttagtc agtgtggaaa
6181 atctctagca gtagtagttc atgtcatctt attattcagt atttataact tgcaaagaaa
6241 tgaatatcag agagtgagag gccttgacat tgctagcgtt taccgtcgac ctctagctag
6301 agcttggcgt aatcatggtc atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt
6361 ccacacaaca tacgagccgg aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta atgagtgagc
6421 taactcacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc
6481 cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct
6541 tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca
6601 gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac
6661 atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt
6721 ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg
6781 cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc
6841 tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc
6901 gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc
6961 aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac
7021 tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt
7081 aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct
7141 aactacggct acactagaag aacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc
7201 ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt
7261 ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg
7321 atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc
7381 atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa
7441 tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag
7501 gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg
7561 tagataacta cgatacggga gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga
7621 gacccacgct caccggctcc agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagggccgag
7681 cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa
7741 gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc
7801 atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca
7861 aggcgagtta catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg
7921 atcgttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc agcactgcat
7981 aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc
8041 aagtcattct gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg
8101 gataataccg cgccacatag cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg
8161 gggcgaaaac tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt
8221 gcacccaact gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca
8281 ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg aatactcata
8341 ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac
8401 atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa
8461 gtgccacctg acgtcgacgg atcgggagat caacttgttt attgcagctt ataatggtta
8521 caaataaagc aatagcatca caaatttcac aaataaagca tttttttcac tgcattctag
8581 ttgtggtttg tccaaactca tcaatgtatc ttatcatgtc tggatcaact ggataactca
8641 agctaaccaa aatcatccca aacttcccac cccataccct attaccactg ccaattacct
8701 gtggtttcat ttactctaaa cctgtgattc ctctgaatta ttttcatttt aaagaaattg
8761 tatttgttaa atatgtacta caaacttagt agtttttaaa gaaattgtat ttgttaaata
8821 tgtactacaa acttagtagt
//
质粒菌株产品操作说明书
一、扩增流程
收到产品后,请先根据产品管壁标签来判断产品形式,并在扩增前准确查找该质粒菌株的抗性、感受态和培养温度。
1、质粒干粉(常温运输,存于-20度,90天保质期,请务必转化挑单克隆培养,不要直接使用和测序)
①收到质粒干粉后请先5000rpm离心1min,再加入20μl ddH2O去离子水溶解质粒;
②取1支100μl 感受态于冰上解冻10min,加入2μl质粒,再冰浴30min后,42℃热激60s,不要搅动,再冰浴2min;(从第二步开始均要在超净工作台中无菌操作)
③加入900μl无抗的LB液体培养基,180rpm震荡37℃培养45min;
④6000rpm离心5min,仅留100μl上清液重悬细菌沉淀,并涂布至目标质粒抗性的LB平板上;(可使用本平台的平板涂布专用玻璃珠进行涂布,可以比传统涂布方法获得更多转化子)
⑤将平板正向培养1h,再倒置37℃培养14h。如果要求是30度则培养20h;
(菌落过多则将质粒稀释后再转化。没有菌落则加入10μl质粒转化。另不要直接转表达感受态,要先转克隆感受态,重提质粒后再导入表达感受态)
⑥挑取单菌落至LB液体培养基中,加入对应抗生素,220rpm震荡培养14h,根据实验需要和质粒提取试剂盒说明书提取质粒。
2、甘油菌种(冰袋运输,存于-80℃,保质期90天,请务必划线挑单克隆培养)
四区划线后挑单菌落培养,酵母菌需要先液体复苏再四区划线,再挑单菌落液体培养。
3、穿刺菌种(冰袋运输,存于4℃,保质期7天)
穿刺接种,液体培养后四区划线,再挑单菌落液体培养。
4、菌落平板(冰袋运输,存于4℃,保质期7天)
直接挑取单菌落至液体培养基中。
5、液体质粒(冰袋运输,存于-20℃,保质期90天)
单独提取的液体质粒收到后可直接使用。
6、滤纸质粒(常温运输,存于-20度,90天保质期,请务必转化挑单克隆培养,不要直接使用和测序)
收到货后将滤纸画圈部分剪下放入EP管中,加100ul无菌水将滤纸浸湿并浸泡5min,吸取5ul质粒转化,离心全涂。
二、转化图片
| P4370/pECMV-3×FLAG-RDH11人源基因质粒 |
| P4371/pECMV-3×FLAG-MPPED2人源基因质粒 |
| P4372/pECMV-3×FLAG-RRP8(1同义突变)人源基因质粒 |
| P4373/pECMV-3×FLAG-NAE1人源基因质粒 |
| P4374/pCDH-CMV-GLUT1-EF1-turboRFP-T2A-Puro人源基因质粒 |
| P4375/pECMV-3×FLAG-TMEM108人源基因质粒 |
| P4376/pECMV-3×FLAG-CALM2人源基因质粒 |
| P4377/pECMV-3×FLAG-TTC14人源基因质粒 |
| P4378/pCDNA3.0-HA-IGHG1人源基因质粒 |
| P4379/pCDNA3.1-3×HA-IKKI人源基因质粒 |
| P4380/pIRESpuro3-3×FLAG-RPL26人源基因质粒 |
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文献和实验入 DMSO 或 2-巯基乙醇,混合后加入 L 连接反应液 (含重组质粒),温和混匀,置冰上 30 min;2. 42 ℃ 水浴 45 秒,然后迅速放回冰中 1~2 min;3. 加入 2 mL LB 培养液,37 ℃ 轻摇荡培养 1 h;4. 4,000×g 离心 10 秒钟,弃上清,用 LB 培养液重悬菌体;5. 将菌液铺于含有适当抗生素的 LB 琼脂培养板上,涂匀,室温放置 20~30 min,倒置于 37 ℃ 孵箱中培养 12~16 h。(三)转化细胞的筛选【实验原理】1、 蓝白筛选:以 TA
毒载体。 2.慢病毒包装与纯化 慢病毒包装采用三质粒或四质粒系统进行包装,收集细胞培养上清,通过超速离心浓缩纯化和收集病毒。 3.慢病毒滴度检测 检测方法:定量PCR检测干扰后细胞基因组中外源DNA拷贝数 实验原理:慢病毒介导外源基因以逆转录方式整合进目的细胞基因组 4.慢病毒载体优势 ① 表达时间长:慢病毒可将外源基因整合到宿主细胞基因组上,实现基因长时间稳定的表达,不随细胞分裂传代而丢失,是细胞实验的首选,常用于构建稳转株 ② 安全性高:未发现致病性,慢病毒载体改造T细胞用于CAR-T
良好的的基因治疗效果,在美国已经开展了临床研究,效果非常理想,因此具有广阔的应用前景。 慢病毒转染优点:1.外源基因表达水平较高、表达稳定;2.转染效率高,可感染分裂和不分裂的细胞,几乎可以感染所有类型的细胞,特别适合质粒载体转染效率低的细胞;3.慢病毒基因容易操作,易于制备大量病毒且滴度高;4.病毒基因组可整合到细胞基因组,易于构建稳定细胞株。 慢病毒包装技术:慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。将外源基因克隆进入表达载体,同时与包装质粒(表达病毒包装所需辅助蛋白)一起转染










