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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 保存条件：
-20
- 保质期：
2年
- 英文名：
PP13;GAL13;PLAC8
- 库存：
100
- 供应商：
上海烜雅生物科技有限公司
- 规格：
干粉/液体
基本信息
名称：pECMV-3×FLAG-LGALS13人源基因质粒
别称: PP13;GAL13;PLAC8
启动子：CMV
复制子: pUC
原核抗性: Amp
筛选标记：G418
克隆菌株: DH5a
培养条件: 37度
质粒属性
载体宿主：哺乳细胞
载体用途：蛋白表达
基因种属：人
基因类型：ORF
原核抗性：Amp
真核抗性：Neo/G418
荧光蛋白：
质粒简介
pECMV-3×FLAG-LGALS13是一个人源基因哺乳表达质粒。
质粒图谱
质粒序列
LOCUS Exported 5872 bp ds-DNA circular SYN 29-SEP-2017
DEFINITION synthetic circular DNA
ACCESSION .
VERSION .
KEYWORDS pECMV-3×FLAG-LGALS13
SOURCE synthetic DNA construct
ORGANISM synthetic DNA construct
REFERENCE 1 (bases 1 to 5872)
AUTHORS .
TITLE Direct Submission
JOURNAL Exported Sep 29, 2017 from MiaoLingPlasmid
http://www.miaolingbio.com
FEATURES Location/Qualifiers
source 1..5872
/organism="synthetic DNA construct"
/mol_type="other DNA"
enhancer 235..614
/label=CMV enhancer
/note="human cytomegalovirus immediate early enhancer"
promoter 615..818
/label=CMV promoter
/note="human cytomegalovirus (CMV) immediate early
promoter"
promoter 863..881
/label=T7 promoter
/note="promoter for bacteriophage T7 RNA polymerase"
CDS 922..987
/codon_start=1
/product="three tandem FLAG(R) epitope tags, followed by an
enterokinase cleavage site"
/label=3xFLAG
/translation="DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK"
misc_feature 1009..1428
/label=LGALS13
polyA_signal 1472..1696
/label=bGH poly(A) signal
/note="bovine growth hormone polyadenylation signal"
rep_origin 1742..2170
/direction=RIGHT
/label=f1 ori
/note="f1 bacteriophage origin of replication; arrow
indicates direction of (+) strand synthesis"
promoter 2184..2513
/label=SV40 promoter
/note="SV40 enhancer and early promoter"
rep_origin 2364..2499
/label=SV40 ori
/note="SV40 origin of replication"
CDS 2580..3374
/codon_start=1
/gene="aph(3')-II (or nptII)"
/product="aminoglycoside phosphotransferase from Tn5"
/label=Neo
/note="confers resistance to neomycin, kanamycin, and G418
(Geneticin(R))"
/translation="MIEQDGLHAGSPAAWVERLFGYDWAQQTIGCSDAAVFRLSAQGRP
VLFVKTDLSGALNELQDEAARLSWLATTGVPCAAVLDVVTEAGRDWLLLGEVPGQDLLS
SHLAPAEKVSIMADAMRRLHTLDPAT-CPFDHQAKHRIERARTRMEAGLVDQDDLDEEHQ
GLAPAELFARLKARMPDGEDLVVTHGDACLPNIMVENGRFSGFIDCGRLGVADRYQDIA
LATRDIAEELGGEWADRFLVLYGIAAPDSQRIAFYRLLDEFF"
polyA_signal 3548..3669
/label=SV40 poly(A) signal
/note="SV40 polyadenylation signal"
rep_origin complement(4120..4705)
/direction=LEFT
/label=ori
/note="high-copy-number ColE1/pMB1/pBR322/pUC origin of
replication"
CDS complement(4876..5736)
/codon_start=1
/gene="bla"
/product="beta-lactamase"
/label=AmpR
/note="confers resistance to ampicillin, carbenicillin, and
related antibiotics"
/translation="MSIQHFRVALIPFFAAFCLPVFAHPETLVKVKDAEDQLGARVGYI
ELDLNSGKILESFRPEERFPMMSTFKVLLCGAVLSRIDAGQEQLGRRIHYSQNDLVEYS
PVTEKHLTDGMTVRELCSAAITMSDNTAANLLLTTIGGPKELTAFLHNMGDHVTRLDRW
EPELNEAIPNDERDTTMPVAMATTLRKLLTGELLTLASRQQLIDWMEADKVAGPLLRSA
LPAGWFIADKSGAGERGSRGIIAALGPDGKPSRIVVIYTTGSQATMDERNRQIAEIGAS
LIKHW"
promoter complement(5737..5841)
/gene="bla"
/label=AmpR promoter
ORIGIN
1 gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg
61 ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg
121 cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc
181 ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt
241 gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata
301 tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc
361 cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc
421 attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt
481 atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt
541 atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca
601 tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg
661 actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc
721 aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg
781 gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca
841 ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gctggctagc
901 gtttaaactt aagccaccat ggactacaaa gaccatgacg gtgattataa agatcatgac
961 atcgactaca aggatgacga tgacaagctt ggtaccgagc tcggatccat gtcttcttta
1021 cccgtgccat acaaactgcc tgtgtctttg tctgttggtt cctgcgtgat aatcaaaggg
1081 acaccaatcc actcttttat caatgaccca cagctgcagg tggatttcta cactgacatg
1141 gatgaggatt cagatattgc cttccgtttc cgagtgcact ttggcaatca tgtggtcatg
1201 aacaggcgtg agtttgggat atggatgttg gaggagacaa cagactacgt gccctttgag
1261 gatggcaaac aatttgagct gtgcatctac gtacattaca atgagtatga gataaaggtc
1321 aatggcatac gcatttacgg ctttgtccat cgaatcccgc catcatttgt gaagatggtg
1381 caagtgtcga gagatatctc cctgacctca gtgtgtgtct gcaattgact cgagtctaga
1441 gggcccgttt aaacccgctg atcagcctcg actgtgcctt ctagttgcca gccatctgtt
1501 gtttgcccct cccccgtgcc ttccttgacc ctggaaggtg ccactcccac tgtcctttcc
1561 taataaaatg aggaaattgc atcgcattgt ctgagtaggt gtcattctat tctggggggt
1621 ggggtggggc aggacagcaa gggggaggat tgggaagaca atagcaggca tgctggggat
1681 gcggtgggct ctatggcttc tgaggcggaa agaaccagct ggggctctag ggggtatccc
1741 cacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc
1801 gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc
1861 acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg gttccgattt
1921 agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc acgtagtggg
1981 ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt ctttaatagt
2041 ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc ttttgattta
2101 taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt
2161 aacgcgaatt aattctgtgg aatgtgtgtc agttagggtg tggaaagtcc ccaggctccc
2221 cagcaggcag aagtatgcaa agcatgcatc tcaattagtc agcaaccagg tgtggaaagt
2281 ccccaggctc cccagcaggc agaagtatgc aaagcatgca tctcaattag tcagcaacca
2341 tagtcccgcc cctaactccg cccatcccgc ccctaactcc gcccagttcc gcccattctc
2401 cgccccatgg ctgactaatt ttttttattt atgcagaggc cgaggccgcc tctgcctctg
2461 agctattcca gaagtagtga ggaggctttt ttggaggcct aggcttttgc aaaaagctcc
2521 cgggagcttg tatatccatt ttcggatctg atcaagagac aggatgagga tcgtttcgca
2581 tgattgaaca agatggattg cacgcaggtt ctccggccgc ttgggtggag aggctattcg
2641 gctatgactg ggcacaacag acaatcggct gctctgatgc cgccgtgttc cggctgtcag
2701 cgcaggggcg cccggttctt tttgtcaaga ccgacctgtc cggtgccctg aatgaactgc
2761 aggacgaggc agcgcggcta tcgtggctgg ccacgacggg cgttccttgc gcagctgtgc
2821 tcgacgttgt cactgaagcg ggaagggact ggctgctatt gggcgaagtg ccggggcagg
2881 atctcctgtc atctcacctt gctcctgccg agaaagtatc catcatggct gatgcaatgc
2941 ggcggctgca tacgcttgat ccggctacct gcccattcga ccaccaagcg aaacatcgca
3001 tcgagcgagc acgtactcgg atggaagccg gtcttgtcga tcaggatgat ctggacgaag
3061 agcatcaggg gctcgcgcca gccgaactgt tcgccaggct caaggcgcgc atgcccgacg
3121 gcgaggatct cgtcgtgacc catggcgatg cctgcttgcc gaatatcatg gtggaaaatg
3181 gccgcttttc tggattcatc gactgtggcc ggctgggtgt ggcggaccgc tatcaggaca
3241 tagcgttggc tacccgtgat attgctgaag agcttggcgg cgaatgggct gaccgcttcc
3301 tcgtgcttta cggtatcgcc gctcccgatt cgcagcgcat cgccttctat cgccttcttg
3361 acgagttctt ctgagcggga ctctggggtt cgaaatgacc gaccaagcga cgcccaacct
3421 gccatcacga gatttcgatt ccaccgccgc cttctatgaa aggttgggct tcggaatcgt
3481 tttccgggac gccggctgga tgatcctcca gcgcggggat ctcatgctgg agttcttcgc
3541 ccaccccaac ttgtttattg cagcttataa tggttacaaa taaagcaata gcatcacaaa
3601 tttcacaaat aaagcatttt tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa
3661 tgtatcttat catgtctgta taccgtcgac ctctagctag agcttggcgt aatcatggtc
3721 atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt ccacacaaca tacgagccgg
3781 aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta atgagtgagc taactcacat taattgcgtt
3841 gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg
3901 ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct cgctcactga
3961 ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat
4021 acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca
4081 aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc
4141 tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata
4201 aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc
4261 gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc
4321 acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga
4381 accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc
4441 ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag
4501 gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag
4561 aacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag
4621 ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtttt tttgtttgca agcagcagat
4681 tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc
4741 tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt
4801 cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta tatatgagta
4861 aacttggtct gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct
4921 atttcgttca tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg
4981 cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac ccacgctcac cggctccaga
5041 tttatcagca ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt
5101 atccgcctcc atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt
5161 taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt
5221 tggtatggct tcattcagct ccggttccca acgatcaagg cgagttacat gatcccccat
5281 gttgtgcaaa aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc
5341 cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc actgcataat tctcttactg tcatgccatc
5401 cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat
5461 gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat aataccgcgc cacatagcag
5521 aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt
5581 accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc
5641 ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa
5701 gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat actcatactc ttcctttttc aatattattg
5761 aagcatttat cagggttatt gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa
5821 taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tc
//
质粒菌株产品操作说明书
一、扩增流程
收到产品后，请先根据产品管壁标签来判断产品形式，并在扩增前准确查找该质粒菌株的抗性、感受态和培养温度。
1、质粒干粉（常温运输，存于-20度，90天保质期，请务必转化挑单克隆培养，不要直接使用和测序）
①收到质粒干粉后请先5000rpm离心1min，再加入20μl ddH2O去离子水溶解质粒；
②取1支100μl 感受态于冰上解冻10min，加入2μl质粒，再冰浴30min后，42℃热激60s，不要搅动，再冰浴2min；（从第二步开始均要在超净工作台中无菌操作）
③加入900μl无抗的LB液体培养基，180rpm震荡37℃培养45min；
④6000rpm离心5min，仅留100μl上清液重悬细菌沉淀，并涂布至目标质粒抗性的LB平板上；（可使用本平台的平板涂布专用玻璃珠进行涂布，可以比传统涂布方法获得更多转化子）
⑤将平板正向培养1h，再倒置37℃培养14h。如果要求是30度则培养20h；
（菌落过多则将质粒稀释后再转化。没有菌落则加入10μl质粒转化。另不要直接转表达感受态，要先转克隆感受态，重提质粒后再导入表达感受态）
⑥挑取单菌落至LB液体培养基中，加入对应抗生素，220rpm震荡培养14h，根据实验需要和质粒提取试剂盒说明书提取质粒。
2、甘油菌种（冰袋运输，存于-80℃，保质期90天，请务必划线挑单克隆培养）
四区划线后挑单菌落培养，酵母菌需要先液体复苏再四区划线，再挑单菌落液体培养。
3、穿刺菌种（冰袋运输，存于4℃，保质期7天）
穿刺接种，液体培养后四区划线，再挑单菌落液体培养。
4、菌落平板（冰袋运输，存于4℃，保质期7天）
直接挑取单菌落至液体培养基中。
5、液体质粒（冰袋运输，存于-20℃，保质期90天）
单独提取的液体质粒收到后可直接使用。
6、滤纸质粒（常温运输，存于-20度，90天保质期，请务必转化挑单克隆培养，不要直接使用和测序）
收到货后将滤纸画圈部分剪下放入EP管中，加100ul无菌水将滤纸浸湿并浸泡5min，吸取5ul质粒转化，离心全涂。
二、转化图片
名称：pECMV-3×FLAG-LGALS13人源基因质粒
别称: PP13;GAL13;PLAC8
启动子：CMV
复制子: pUC
原核抗性: Amp
筛选标记：G418
克隆菌株: DH5a
培养条件: 37度
质粒属性
载体宿主：哺乳细胞
载体用途：蛋白表达
基因种属：人
基因类型：ORF
原核抗性：Amp
真核抗性：Neo/G418
荧光蛋白：
质粒简介
pECMV-3×FLAG-LGALS13是一个人源基因哺乳表达质粒。
质粒图谱
质粒序列
LOCUS Exported 5872 bp ds-DNA circular SYN 29-SEP-2017
DEFINITION synthetic circular DNA
ACCESSION .
VERSION .
KEYWORDS pECMV-3×FLAG-LGALS13
SOURCE synthetic DNA construct
ORGANISM synthetic DNA construct
REFERENCE 1 (bases 1 to 5872)
AUTHORS .
TITLE Direct Submission
JOURNAL Exported Sep 29, 2017 from MiaoLingPlasmid
http://www.miaolingbio.com
FEATURES Location/Qualifiers
source 1..5872
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/label=CMV enhancer
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promoter"
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enterokinase cleavage site"
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indicates direction of (+) strand synthesis"
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/note="SV40 enhancer and early promoter"
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GLAPAELFARLKARMPDGEDLVVTHGDACLPNIMVENGRFSGFIDCGRLGVADRYQDIA
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EPELNEAIPNDERDTTMPVAMATTLRKLLTGELLTLASRQQLIDWMEADKVAGPLLRSA
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LIKHW"
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ORIGIN
1 gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg
61 ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg
121 cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc
181 ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt
241 gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata
301 tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc
361 cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc
421 attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt
481 atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt
541 atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca
601 tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg
661 actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc
721 aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg
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961 atcgactaca aggatgacga tgacaagctt ggtaccgagc tcggatccat gtcttcttta
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1081 acaccaatcc actcttttat caatgaccca cagctgcagg tggatttcta cactgacatg
1141 gatgaggatt cagatattgc cttccgtttc cgagtgcact ttggcaatca tgtggtcatg
1201 aacaggcgtg agtttgggat atggatgttg gaggagacaa cagactacgt gccctttgag
1261 gatggcaaac aatttgagct gtgcatctac gtacattaca atgagtatga gataaaggtc
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2041 ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc ttttgattta
2101 taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt
2161 aacgcgaatt aattctgtgg aatgtgtgtc agttagggtg tggaaagtcc ccaggctccc
2221 cagcaggcag aagtatgcaa agcatgcatc tcaattagtc agcaaccagg tgtggaaagt
2281 ccccaggctc cccagcaggc agaagtatgc aaagcatgca tctcaattag tcagcaacca
2341 tagtcccgcc cctaactccg cccatcccgc ccctaactcc gcccagttcc gcccattctc
2401 cgccccatgg ctgactaatt ttttttattt atgcagaggc cgaggccgcc tctgcctctg
2461 agctattcca gaagtagtga ggaggctttt ttggaggcct aggcttttgc aaaaagctcc
2521 cgggagcttg tatatccatt ttcggatctg atcaagagac aggatgagga tcgtttcgca
2581 tgattgaaca agatggattg cacgcaggtt ctccggccgc ttgggtggag aggctattcg
2641 gctatgactg ggcacaacag acaatcggct gctctgatgc cgccgtgttc cggctgtcag
2701 cgcaggggcg cccggttctt tttgtcaaga ccgacctgtc cggtgccctg aatgaactgc
2761 aggacgaggc agcgcggcta tcgtggctgg ccacgacggg cgttccttgc gcagctgtgc
2821 tcgacgttgt cactgaagcg ggaagggact ggctgctatt gggcgaagtg ccggggcagg
2881 atctcctgtc atctcacctt gctcctgccg agaaagtatc catcatggct gatgcaatgc
2941 ggcggctgca tacgcttgat ccggctacct gcccattcga ccaccaagcg aaacatcgca
3001 tcgagcgagc acgtactcgg atggaagccg gtcttgtcga tcaggatgat ctggacgaag
3061 agcatcaggg gctcgcgcca gccgaactgt tcgccaggct caaggcgcgc atgcccgacg
3121 gcgaggatct cgtcgtgacc catggcgatg cctgcttgcc gaatatcatg gtggaaaatg
3181 gccgcttttc tggattcatc gactgtggcc ggctgggtgt ggcggaccgc tatcaggaca
3241 tagcgttggc tacccgtgat attgctgaag agcttggcgg cgaatgggct gaccgcttcc
3301 tcgtgcttta cggtatcgcc gctcccgatt cgcagcgcat cgccttctat cgccttcttg
3361 acgagttctt ctgagcggga ctctggggtt cgaaatgacc gaccaagcga cgcccaacct
3421 gccatcacga gatttcgatt ccaccgccgc cttctatgaa aggttgggct tcggaatcgt
3481 tttccgggac gccggctgga tgatcctcca gcgcggggat ctcatgctgg agttcttcgc
3541 ccaccccaac ttgtttattg cagcttataa tggttacaaa taaagcaata gcatcacaaa
3601 tttcacaaat aaagcatttt tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa
3661 tgtatcttat catgtctgta taccgtcgac ctctagctag agcttggcgt aatcatggtc
3721 atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt ccacacaaca tacgagccgg
3781 aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta atgagtgagc taactcacat taattgcgtt
3841 gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg
3901 ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct cgctcactga
3961 ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat
4021 acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca
4081 aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc
4141 tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata
4201 aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc
4261 gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc
4321 acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga
4381 accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc
4441 ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag
4501 gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag
4561 aacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag
4621 ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtttt tttgtttgca agcagcagat
4681 tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc
4741 tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt
4801 cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta tatatgagta
4861 aacttggtct gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct
4921 atttcgttca tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg
4981 cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac ccacgctcac cggctccaga
5041 tttatcagca ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt
5101 atccgcctcc atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt
5161 taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt
5221 tggtatggct tcattcagct ccggttccca acgatcaagg cgagttacat gatcccccat
5281 gttgtgcaaa aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc
5341 cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc actgcataat tctcttactg tcatgccatc
5401 cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat
5461 gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat aataccgcgc cacatagcag
5521 aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt
5581 accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc
5641 ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa
5701 gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat actcatactc ttcctttttc aatattattg
5761 aagcatttat cagggttatt gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa
5821 taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tc
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质粒菌株产品操作说明书
一、扩增流程
收到产品后，请先根据产品管壁标签来判断产品形式，并在扩增前准确查找该质粒菌株的抗性、感受态和培养温度。
1、质粒干粉（常温运输，存于-20度，90天保质期，请务必转化挑单克隆培养，不要直接使用和测序）
①收到质粒干粉后请先5000rpm离心1min，再加入20μl ddH2O去离子水溶解质粒；
②取1支100μl 感受态于冰上解冻10min，加入2μl质粒，再冰浴30min后，42℃热激60s，不要搅动，再冰浴2min；（从第二步开始均要在超净工作台中无菌操作）
③加入900μl无抗的LB液体培养基，180rpm震荡37℃培养45min；
④6000rpm离心5min，仅留100μl上清液重悬细菌沉淀，并涂布至目标质粒抗性的LB平板上；（可使用本平台的平板涂布专用玻璃珠进行涂布，可以比传统涂布方法获得更多转化子）
⑤将平板正向培养1h，再倒置37℃培养14h。如果要求是30度则培养20h；
（菌落过多则将质粒稀释后再转化。没有菌落则加入10μl质粒转化。另不要直接转表达感受态，要先转克隆感受态，重提质粒后再导入表达感受态）
⑥挑取单菌落至LB液体培养基中，加入对应抗生素，220rpm震荡培养14h，根据实验需要和质粒提取试剂盒说明书提取质粒。
2、甘油菌种（冰袋运输，存于-80℃，保质期90天，请务必划线挑单克隆培养）
四区划线后挑单菌落培养，酵母菌需要先液体复苏再四区划线，再挑单菌落液体培养。
3、穿刺菌种（冰袋运输，存于4℃，保质期7天）
穿刺接种，液体培养后四区划线，再挑单菌落液体培养。
4、菌落平板（冰袋运输，存于4℃，保质期7天）
直接挑取单菌落至液体培养基中。
5、液体质粒（冰袋运输，存于-20℃，保质期90天）
单独提取的液体质粒收到后可直接使用。
6、滤纸质粒（常温运输，存于-20度，90天保质期，请务必转化挑单克隆培养，不要直接使用和测序）
收到货后将滤纸画圈部分剪下放入EP管中，加100ul无菌水将滤纸浸湿并浸泡5min，吸取5ul质粒转化，离心全涂。
二、转化图片
| P1152/pAKTaq聚合酶基因质粒 |
| P1411/pET-KOD聚合酶基因质粒 |
| P0315/pET22b-KOD聚合酶基因质粒 |
| P0776/pKOD-3聚合酶基因质粒 |
| P1407/pET16B.Pfu聚合酶基因质粒 |
| P1758/pECMV-3×FLAG-T7 RNA polymerase聚合酶基因质粒 |
| P1775/T7opt in pCAGGS(T7 RNA polymerase)聚合酶基因质粒 |
| P3218/pCAG-T7pol聚合酶基因质粒 |
| P2140/DCT.VV.Orf170聚合酶基因质粒 |
| P2637/pK19mobSacB-T7 polymerase聚合酶基因质粒 |
| P2835/pSG5-BALF5聚合酶基因质粒 |
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文献和实验相关实验
入 DMSO 或 2-巯基乙醇，混合后加入 L 连接反应液 (含重组质粒)，温和混匀，置冰上 30 min；2. 42 ℃ 水浴 45 秒，然后迅速放回冰中 1～2 min；3. 加入 2 mL LB 培养液，37 ℃ 轻摇荡培养 1 h；4. 4,000×g 离心 10 秒钟，弃上清，用 LB 培养液重悬菌体；5. 将菌液铺于含有适当抗生素的 LB 琼脂培养板上，涂匀，室温放置 20～30 min，倒置于 37 ℃ 孵箱中培养 12～16 h。（三）转化细胞的筛选【实验原理】1、 蓝白筛选:以 TA
毒载体。 2.慢病毒包装与纯化 慢病毒包装采用三质粒或四质粒系统进行包装，收集细胞培养上清，通过超速离心浓缩纯化和收集病毒。 3.慢病毒滴度检测 检测方法：定量PCR检测干扰后细胞基因组中外源DNA拷贝数 实验原理：慢病毒介导外源基因以逆转录方式整合进目的细胞基因组 4.慢病毒载体优势 ① 表达时间长：慢病毒可将外源基因整合到宿主细胞基因组上，实现基因长时间稳定的表达，不随细胞分裂传代而丢失，是细胞实验的首选，常用于构建稳转株 ② 安全性高：未发现致病性，慢病毒载体改造T细胞用于CAR-T
良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。 慢病毒转染优点：1.外源基因表达水平较高、表达稳定；2.转染效率高，可感染分裂和不分裂的细胞，几乎可以感染所有类型的细胞，特别适合质粒载体转染效率低的细胞；3.慢病毒基因容易操作，易于制备大量病毒且滴度高；4.病毒基因组可整合到细胞基因组，易于构建稳定细胞株。 慢病毒包装技术：慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。将外源基因克隆进入表达载体，同时与包装质粒（表达病毒包装所需辅助蛋白）一起转染
pECMV-3×FLAG-LGALS13人源基因质粒
￥100 - 1000
