外周血PBMC分离

人外周血单个核细胞（Peripheralblood mononuclear cells ，PBMCs ）的分离制备：

1）医院及其血液中心采取的新鲜的肝素抗凝的2ml外周静脉血备用；

2）将肝素抗凝的静脉血用等体积的PBS稀释并充分混匀；

3）将人淋巴细胞分离液ficoll从 4 °C 取出，恢复至室温，取4ml转移至15ml 试管中备用；

4）用无菌吸管吸取稀释后的静脉血，沿管壁缓慢入至人淋巴细胞分离液液面上

（ficoll分离液：抗凝血1:1），缓缓地不要晃荡，保持界面的清楚；

5）将加完外周静脉血后的 50 ml 试管放入台式离心机中，2200 rpm 水平离心，

室温 25 min，注意离心机升降速都调至最慢，降速设置中一定要设置成no break，或者只有1成的制动。

6）离心完毕后，小心取出15 ml 试管，离心后管内可分为三层，在上、中层界面处有一层以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带，即为我们所需要的单个核细胞；

7）用无菌吸管吸取白色云雾层狭窄带的单个核细胞，并置于另一 15 ml 离心管

中，加入5mlPBS，1500 rpm，室温离心 5min，并充分洗涤细胞两次；

8）末次离心后，弃去上清，加入完全 RPMI 1640 培养液重悬细胞，充分混匀；

9）用白细胞计数液计数单个核细胞，根据实验所需，加入完全 1640培养液调整细胞浓度到所需要的浓度。



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