CCK-8增殖检测

Cell Counting Kit-8（简称CCK-8）是一种基于WST-8的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的检测试剂。WST-8【化学名：2-(2-甲氧基-4-硝J苯基)-3-(4-硝J苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】，是一种类似于MTT的化合物，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸2甲酯（1-Methoxy PMS）存在的情况下，被线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的橙黄色甲瓒产物（formazan）。细胞增殖越多越快，颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅，对于同样的细胞，颜色的深浅与活细胞的数量成正比，因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。
 

图1. CCK-8检测原理图

CCK-8的优点

• 产生的甲瓒产物是水溶性的，无需换液，适合悬浮细胞

• 不需要放射性同位素和有机溶剂，对细胞的毒性小

• CCK-8细胞活性检测试剂毋需预制，即开即用

• 灵敏度高，线性范围宽，数据可靠，重现性好

• 操作简便，省时省力

• 适合于高通量药物筛选

CCK-8的缺点：

• 与MTT法相比，CCK-8的价格比较贵

• CCK-8试剂的颜色为淡红色，与含酚红的培养基颜色接近，操作过程中容易漏加或多加

实验一：细胞增殖分析

1）制备细胞悬液，计数。
2）在96孔板中接种细胞悬液，每孔约100μl，同样的样本可做3个重复。
3）将培养板放入培养箱中预培养一段时间（37℃, 5%CO₂），细胞贴壁需要大约2-4h，如果是悬浮细胞，该步骤可以省去。
4）每孔各加入10μl CCK-8溶液，由于加入的CCK-8量比较少，可能会因试剂沾在孔壁上而带来误差，建议在加完试剂后轻轻晃动培养板以帮助混匀，或者直接配置含10%CCK-8的培养基，以换液的形式加入。另外注意，加样的过程中尽量不要产生气泡。
5）将培养板放入培养箱中孵育1-4h。因为细胞种类不同，形成的formazan的量也不一样，所以如果显色不够的话，可以延长培养时间，特别是血液细胞形成的formazan很少，需要较长的显色时间（5-6h）。
6）酶标仪测定450nm处的吸光值（OD）。
7）若暂时不测定OD值，可以在各孔中加入10μl 0.1 M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，室温下避光保存，这样可以保证OD值在24h内不发生变化。

实验二：细胞毒性分析

1）制备细胞悬液，计数。
2）在96孔板中接种细胞悬液，每孔约100μl，同样的样本可做3个重复。
3）将培养板放入培养箱中预培养一段时间（37℃, 5%CO₂），细胞贴壁需要大约2-4h，如果是悬浮细胞，该步骤可以省去。
4）向培养板各孔中加入不同浓度的毒性物质（药物、化学试剂等待检测物质）。
5）将培养板放入培养箱中孵育一段时间，例如6、12、24、48h，具体时间要看待测物质的性质和细胞的敏感性。
如果待检测物质有氧化性或还原性，可在加入CCK-8之前更换新鲜培养基，以去掉待测物质的影响。如果影响比较小或者没有影响，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。
6）向每孔中加入10μl CCK-8溶液，由于加入的CCK-8量比较少，可能会因试剂沾在孔壁上而带来误差，建议在加完试剂后轻轻晃动培养板以帮助混匀，或者直接配置含10%CCK-8的培养基，以换液的形式加入。另外注意，加样的过程中尽量不要产生气泡，以免影响OD值读数。
7）将培养板放入培养箱中孵育1-4h。因为细胞种类不同，形成的formazan的量也不一样，所以如果显色不够的话，可以延长培养时间，特别是血液细胞形成的formazan很少，需要较长的显色时间（5-6h）。
8）用酶标仪测定450nm处的吸光度（OD）。
9）若暂时不测定OD值，可以在各孔中加入10μl 0.1 M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，室温避光保存，这样可以保证OD值24h内不发生变化。

活力计算：

细胞活力（%）=[A(加药)-A(空白)]/[A(0加药)-A(空白)] ×100
A（加药）：具有细胞、CCK-8溶液和药物溶液的孔的OD值
A（0加药）：具有细胞、CCK-8溶液而没有药物溶液的孔的OD值
A（空白）：没有细胞的孔的OD值
细胞活力：细胞增殖活力或细胞毒性活力

注意事项：

• 接种细胞数：针对标准96孔板，贴壁细胞的最小接种量为1000个/孔 (100μl培养基)。若为白细胞，接种量不低于2500个/孔 (100μl培养基)。如若使用24孔板或6孔板，应预先计算每孔相应的接种量，并按照每孔培养基总体积的10%加入CCK-8溶液。

• CCK-8 反应时间：悬浮细胞与贴壁细胞相比较难显色，因此需要增加细胞数量并延长CCK-8反应时间。另外，在培养箱中孵育期间，培养板最外一圈的孔最容易干燥挥发，造成体积不准确，从而增加误差，因此，建议最外一圈的孔只加培养基，不作为测定孔用。另外，如果细胞培养时间较长导致培养基颜色发生了变化，应洗涤细胞更换培养基后再加CCK-8进行检测。

• 空白对照：在不含细胞的培养基中加入CCK-8，测定450nm的吸光度即为空白对照。在细胞毒性实验中，还应考虑药物的吸收，可在加入药物的培养基中加入CCK-8，测定450nm的吸光度作为空白对照。

• 测定波长：如果样品为高浑浊度的细胞悬液，建议采用双波长进行测定，检测波长450-490nm，参比波长600-650nm。

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