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- 2025年11月10日
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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 库存：
100
- 英文名：
pT7-His-EGFP
- 保质期：
5年
- 供应商：
上海烜雅生物科技有限公司
- 保存条件：
-20℃
名称：pT7-His-EGFP大肠荧光质粒
别称: pT7-His-EGFP
| 启动子: | T7 |
|---|---|
| 复制子: | pBR322 |
| 原核抗性: | Kan |
| 克隆菌株: | DH5a |
| 培养条件: | 37度 |
质粒属性
| 载体宿主： | 大肠杆菌 |
|---|---|
| 载体用途： | 蛋白表达 |
| 基因种属： | |
| 基因类型： | ORF |
| 原核抗性： | Kan |
| 真核抗性： | |
| 荧光蛋白： | 绿色 |
质粒简介：祥询
质粒序列：祥询
质粒菌株产品操作说明书
一、扩增流程
收到产品后，请先根据产品管壁标签来判断产品形式，并在扩增前准确查找该质粒菌株的抗性、感受态和培养温度。
1、质粒干粉（常温运输，存于-20度，90天保质期，请务必转化挑单克隆培养，不要直接使用和测序）
①收到质粒干粉后请先5000rpm离心1min，再加入20μl ddH2O去离子水溶解质粒；
②取1支100μl 感受态于冰上解冻10min，加入2μl质粒，再冰浴30min后，42℃热激60s，不要搅动，再冰浴2min；（从第二步开始均要在超净工作台中无菌操作）
③加入900μl无抗的LB液体培养基，180rpm震荡37℃培养45min；
④6000rpm离心5min，仅留100μl上清液重悬细菌沉淀，并涂布至目标质粒抗性的LB平板上；（可使用本平台的平板涂布专用玻璃珠进行涂布，可以比传统涂布方法获得更多转化子）
⑤将平板正向培养1h，再倒置37℃培养14h。如果要求是30度则培养20h；
（菌落过多则将质粒稀释后再转化。没有菌落则加入10μl质粒转化。另不要直接转表达感受态，要先转克隆感受态，重提质粒后再导入表达感受态）
⑥挑取单菌落至LB液体培养基中，加入对应抗生素，220rpm震荡培养14h，根据实验需要和质粒提取试剂盒说明书提取质粒。
2、甘油菌种（冰袋运输，存于-80℃，保质期90天，请务必划线挑单克隆培养）
四区划线后挑单菌落培养，酵母菌需要先液体复苏再四区划线，再挑单菌落液体培养。
3、穿刺菌种（冰袋运输，存于4℃，保质期7天）
穿刺接种，液体培养后四区划线，再挑单菌落液体培养。
4、菌落平板（冰袋运输，存于4℃，保质期7天）
直接挑取单菌落至液体培养基中。
5、液体质粒（冰袋运输，存于-20℃，保质期90天）
单独提取的液体质粒收到后可直接使用。
6、滤纸质粒（常温运输，存于-20度，90天保质期，请务必转化挑单克隆培养，不要直接使用和测序）
收到货后将滤纸画圈部分剪下放入EP管中，加100ul无菌水将滤纸浸湿并浸泡5min，吸取5ul质粒转化，离心全涂。
二、转化图片
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文献和实验，比如说，你用的是ＰＬＥＧＦ载体，抗性为Ｇ４１８，按不同的浓度检测如：200μg/ml、400μg/ml－－－－１２００ug/ml共６个梯度，细胞量最好的１０００Cell/ml，以１０－１４天最低浓度至全部细胞死亡为最佳浓度，我用的是ＰＴ６７最佳浓度为８００ug/ml4、转染，观察２４－４８h的转染情况，如达４０%以上，可加入Ｇ４１８筛选，３－５天换一次带药的培养液，一般在１５天即可，具体还看转入不同基因可以有差异，得到较高带ＥＧＦＰ的细胞。５、扩大培养，收集上清。６、收集到的上清可以做密度
荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein．EGFP)克隆至它的多克隆位点，观察其在COS-7细胞中的表达。 材料与方法 试剂 各种限制性内切酶；T DNA连接酶、无DNA酶的RNA酶和100 bp DNAMarker；Klenow酶；Lambda DNA HindIll Marker；Trizol试剂、Taq DNA聚合酶和琼脂糖；酵母抽提物、胰蛋白胨；DNA凝胶回收试剂盒、质粒DNA分离纯化试剂盒；Lipofectamine 2000阳离子脂质体、Opti
pCF-T M13F M13R pCI T7（17Base） 此载体无反向引物 pCI-neo T7（17Base） T3 pCMS-EGFP T7 T3 pCMV-3Tag-4A T3 /PFLAG-CMV-F T7 pCMV5 pCMV5F pCMV5R pCMV5-Flag pCMV5F pCMV5R pCMV-MYC/HA pCMV-F pCMV-R pCMV-Sport M13F/T7 SP6/M13R pCMV-Tag(KAN+) T3 T7 pCR2.1-TOPO
