wh2008: 冰冻切片,结果假阳性太多,是否可以不进行修复呢
1. 抗原修复的原因是标本在甲醛等固定过程中,因发生蛋白交联和甲醛的封闭作用使抗原性降低,可以通过抗原修复使抗原决定族充分暴露出来; 2. 免疫组化中经常使用抗原修复,因为它的原理主要是抗原和抗体反应,通过抗原修复使更多的抗原与抗体结合,避免假阴性结果; 3. 而TUNEL的原理是dUTP与断裂的DNA上的3'OH结合,故不需抗原修复; 4. 第一次TUNEL反应只需37度反应1 h ,或者延长时间即可。
发表于2008-04-22 11:44
1. 充分脱蜡和水化。脱蜡可以先60度20 min,再用二甲苯两次5~10 min;而水化用梯度乙醇从高浓度到低浓度浸洗,这些以便后面的结合反应充分、均匀。 2. 把握好细胞通透的时间。一般根据切片的厚薄,选择蛋白酶k的孵育时间,常用10~30 min,几um切片用短时间;几十um切片用长时间,通过摸索达到既不脱片,有能够使后面的酶和抗体进入胞内。 3. 适当延长TUNEL反应液的时间。一般是37度1h,你也可以根据你的凋亡损伤程度,选择更长的时间,可长至2 h,但要结合你最终的背景着色。 4. DAB显色条件的选择。一般DAB反应10分钟左右,结合镜下控制背景颜色,最长不超过30 min;我不喜欢用promega公司提供的DAB液(桃红色),不利于辨认棕褐色。 5.PBS的充分清洗。我个人认为,在TUNEL反应后和酶标反应后的清洗应十分严格,可增加次数达5次,因为这些清洗直接决定最后切片的非特异性着色。 6. 此外,内源性POD的封闭也十分关键。对于肝脏、肾脏等血细胞含量多的组织,我的经验是适当延长封闭时间和升高过氧化氢的浓度,可以达到很好的封闭效果,且不影响最终的特异性染色。
发表于2008-04-18 18:36
如果你仅仅是一般地细胞凋亡,可以用Annexin V-FITC&PI,这个凯基公司有的,我用过。好像是20T,5-600RMB。 如果你还涉及到了细胞内本身表达报告基因,诸如(E)GFP之类的,你可以买BD公司的Annexin V-PE/7-AAD(cat no. 556422)。 如果你想更简单的,就像别人要点点DAPI,染色观察,凋亡细胞和正常细胞的细胞核染色不一样的。
发表于2009-04-28 21:04
本课题组对细胞凋亡诱导的肝损伤进行了系列研究,已经发表了几篇SCI论文,在研究和投稿中,进一步对几种常用细胞凋亡检测方法有所了解,即TUNEL、DNA ladder、组织Caspase 3活性、免疫组化检测Caspase 3表达和几种凋亡相关基因的表达等方法。 现在把这几种方法的优缺点与大家进行分享和讨论,以便新手能够正确选择其中的某种方法进行实验研究。
发表于2008-07-06 14:30