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实验材料 | |
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试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 |
一、包被96孔板
用70%乙醇浸润96孔板中的PVDF膜30 s
加入捕获抗体(PBS稀释),4℃过夜
倒空板中包被液,轻轻在纸上拍干,用PBS洗涤,禁用洗板机
加入100ul 2%的脱脂奶粉(或者BSA)室温孵育2小时,封闭板中空白位点
PBS洗涤1次。(如果暂时不用,可将96孔板干燥后4保存,可保存2周以上)
二、细胞刺激和细胞因子捕获
从新鲜血液中用Ficoll分离PBMC并进行计后,将细胞用培养液稀释后加入96孔板中。细胞数量需要优化,最好进行备比稀释以确定合适的细胞数量。通常所用细胞数量为1-2×105/孔。
将96孔板在37℃ CO2孵箱中孵育过夜。禁止移动或晃动板子。
用含0.1% Tween 20 的PBS孵育10分钟,去除细胞和未结合的细胞因子。然后用含0.1% Tween 20 的PBS洗涤3次。 禁用洗板机。
三、加入检测抗体检测
加入标记的检测抗体(用含1%BSA的PBS稀释),室温孵育1-2小时。
加入底物显色(如果检测抗体为酶标)或者荧光直接检测(如果检测抗体是荧光标记):在加入底物之前用蒸馏水洗涤板子膜的两侧,以防止部分溶液漏出后导致的背景。监测斑点的形成,适时终止反应。
用蒸馏水洗涤终止反应。
四、结果分析
将96孔板干燥。(将板子放在4℃避光过夜,可使斑点边缘锐化,更易分辨)
使用读板仪进行结果分析
ELISpot实验需要的试剂:
PVDF包被的96孔板 包被抗体 标记的检测抗体(酶、Biotin、荧光) AP/HRP-链霉亲和素(如果检测抗体是Biotin标记) 底物溶液 各种缓冲液:包被液、稀释液、洗涤液等 阳性对照:重组的细胞因子或者已知产生细胞因子的细胞 96孔板- 硝基纤维素底板、
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其他 |
一、PVDF-底的免疫斑点板或者平底的酶标板 ELISpot技术要点
1. 操作BCIP/NBT显色液时最好戴上手套。
2. 为了防止边缘影响,最好在96孔扳外面包裹锡箔膜,包裹直到显色结束再弃去。
3. 加样细胞和试剂时加样枪头千万不能碰触孔底的PVDF膜,以防止损坏PVDF膜。
4. 常用的96孔扳虽然不是无菌的,但是短暂的孵育时间和培养液中抗生素的存在,ELISpot的操作过程不会有污染的麻烦。
5. 绝大部分板子只能一次做完,请务必在实验开始之前设计好实验方案,尽量最大程度地利用板孔和试剂。
6. 检测抗体和酶最好现配现用。
7. 为保证结果的准确性,建议作双复孔或三复孔。
8. 实验结束后,不要在高于37℃的温度下干燥,否则PVDF膜可能会破裂。
9. 推荐以下对照设定:
(1)阳性对照:重组细胞因子或确定能分泌该种细胞因子的细胞 阴性对照:相同数量的未刺激细胞 背景对照:无菌细胞培养液 检测抗体对照:用PBS代替检测抗体
二、ELISpot技术介绍
从单细胞水平观察分泌蛋白的表达已成为目前研究细胞功能的重要内容,酶联免疫斑点法(ELISpot)技术巧妙地运用了酶联免疫吸附技术,从方法上解决了该难题,已广泛运用于各项重要课题研究中。ELISpot最初用于检测分泌抗原特异性抗体的个体B细胞,以后该方法不断改进,用于检测分泌特定抗原的单个细胞。
相比较于流式细胞仪、免疫组化、原位杂交等其它在单细胞水平检测蛋白分泌能力的方法,ELISpot方法更为简单和稳定,同时具有更高的灵敏度。 ELISpot方法操作简便,但却能提供非常类似于体内实验的环境。在单细胞水平进行特定抗原的监控,可以模拟体内环境,跟踪细胞因子的产生,是检测细胞功能的独特手段。现已被广泛运用于世界各大实验室的疾病诊断和科学研究活动之中。
自1983年以来,ELISpot方法得到越来越广泛的应用,主要包括以下几个方面:
B细胞杂交瘤的筛选、 化合物和药物免疫学反应的筛选、 优化树突细胞和T细胞的抗肿瘤活性、 靶向疫苗的质控、 自身免疫疾病的诊断和预后分析、 自身免疫疾病的免疫治疗的监控、 过敏性疾病的脱敏治疗的监测、 器官移植中排斥反应的预测 、干细胞功能分析、 基因治疗中转染效率的检测、组织、肿瘤和免疫细胞低频分泌谱的分析等等。
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实验方法原理 | ELISPOT技术原理,一句话概括就是:用抗体捕获培养中的细胞分泌的细胞因子,并以酶联斑点显色的方式将其表现出来。 |
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实验材料 | |
试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 |
一、ELISPOT包被
1. 设计好实验,把每个孔要加入的内容做成卡片,到时候就会从容很多。
2. 每孔加入15 μL 70%的乙醇预湿30秒。
3. 加入100 μL去离子水洗涤三次,尽量减少乙醇的残留。
4. 按照试剂盒的使用说明,将包被抗体储存液稀释在PBS缓冲液中,每孔加入50 μL,4°C包被过夜。
5. (次日)倾倒包被液,用PBS洗涤5次,最后一次,在灭菌的吸水纸上扣干。
6. 加入200 μL试剂盒自带的稀释好的封闭液,37°C封闭1小时。
7. 倾倒封闭液,无须洗涤,直接可以进行细胞培养。(也可以用PBS缓冲液或者纯水洗涤一次,拍干,封口,4°C保存,可以在4°C保存数周。)
二、铺细胞,加入刺激物,培养
整个实验设置一组正对照(PHA刺激),每一个细胞样品(同一个捐献者或者实验动物)要设一个负对照(不加刺激物),整块板还要加一个背景负对照(不含细胞,只加培养基和所有的检测试剂)。
1. 填好实验卡片,用以指导实验的安排和细胞及试剂的添加。每一个细胞/刺激物的组合设置2-4个孔的重复(想要有统计学的意义,每个细胞/刺激物设4个孔的重复)。
2. 取出封闭好的板,准备加入细胞。如果是以前做的封闭,可以加入200 μL的U-Cytech无血清培养基,室温静置10分钟,倾倒,然后再重复一次。
3. 按照实验卡片的安排,加入不同浓度的细胞,100 μL/well,细胞在孔中的分布要尽量均匀(要诀是加入细胞之后,不要再震动或者拍击ELISPOT板。有人认为拍击板子会让细胞更分散,实际情况刚好相反)。正对照的细胞浓度为1x105/well,实验组的样品细胞浓度请自行调整。
4. 加入100 μL的U-Cytech无血清培养基到背景负对照孔。
5. 正对照孔加入10 μL PHA,终浓度4 ug/mL,该浓度能有效刺激IFN-γ的分泌。
6. 加入实验者自己的刺激物(配制成10×终浓度,10μL/well)到实验孔。加完刺激物之后不要再拍击ELISPOT板。
7.当加完所有的样品之后,盖上板盖,放入二氧化碳培养箱,37°C培养18-24小时。
三、培养后操作
1. 倾倒孔内的细胞及培养基。
2.低渗法将细胞裂解,每孔加入200 μL冰冷的去离子水,将板置于冰上冰浴10分钟。
3.每孔用200 μLPBST洗涤10遍,洗涤最后一遍之后,将板倒扣在吸水纸上拍干。
4.按照试剂盒说明的浓度,用抗体稀释液稀释检测抗体,每孔加入100 μL生物素标记的检测抗体,37°C1小时。
5. 每孔用200 μL PBST洗涤5遍,洗涤最后一遍时,将PVDF膜板的背面的塑料保护层取下,同时洗涤膜的正反两面,盖上保护层,将板倒扣在吸水纸上拍干。
6. 按照试剂盒说明的浓度,用抗体稀释液稀释酶标的链霉亲和素,每孔加入100 μL,37°C1小时。
7. 每孔用200 μLPBST洗涤5遍,洗涤最后一遍时,将PVDF膜板的背面的塑料保护层取下,同时洗涤膜的正反两面,盖上保护层,将板倒扣在吸水纸上拍干。
8. 照试剂盒的说明,解冻已配好的AEC显色液。每孔加入100 μL的显色液,室温静置20-30分钟,注意避光。
9. 待斑点生长到适合的大小之后,以去离子水洗涤2遍,终止显色过程。将板倒扣在吸水纸上,拍干细小的水珠,之后取下保护层,放在通风的地方,室温静置10-30分钟,让膜自然晾干。注意不要将板放到烤箱内,防止膜发脆、破裂。
10. 将ELISPPOT板置于ELISPOT自动读数仪内,调节好合适的参数,半点计数,并记录斑点的各种参数,作统计分析。
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注意事项 |
一、ELISPOT包被
1. 未润湿的PVDF膜是洁白的、不透明的,经过乙醇润湿之后,颜色变暗,变成半透明状,很容易观察二者的区别。
2. 加乙醇的时候,枪头应该靠在孔壁接近孔底的地方,注意枪头不到刺到PVDF膜。
3. 有时候,加入的乙醇挂在孔壁上,这时要盖上板盖,轻轻叩击,让乙醇顺势滑落。乙醇一旦接触到PVDF膜,就会在表面张力和毛细作用之下迅速浸润整块膜,使得膜的颜色和透明度发生变化。
4.15 μL是经过优化的体积,它能保证刚好完全浸润整块膜,而不会有剩余。如果加大使用量,乙醇溶液就会透过膜而积存在膜的背面,加深实验的背景。
二、铺细胞,加入刺激物,培养
当加完所有的样品之后,盖上板盖,放入二氧化碳培养箱,37°C培养18-24小时。注意在整个培养过程中避免移动、碰撞培养板。为了取得更好的结果,甚至开关培养箱的箱门也应该禁止。因为碰撞会造成细胞的移位,造成斑点的模糊、拖尾。
三、培养后操作
洗涤膜的背面,在一个浅托盘中盛上干净的PBST,将膜板的底面浸入,轻轻摇晃几次即可。注意,一定要将膜的背面和塑料保护层上的液体甩干之后,再合拢,盖上,不要伤害到膜。
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实验方法原理 | 细胞受到刺激后局部产生细胞因子,此细胞因子被特异单克隆抗体捕获。细胞分解后, 被捕获的细胞因子与生物素标记的二抗结合,其后再与碱性磷酸酶标记的亲和素结合。BCIP/NBT底物孵育后,PVDF孔板出现"紫色"的斑点表明细胞产生了细胞因子,通过ELISPOT酶联斑点分析系统对斑点的分析后得出结果。 |
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试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 |
一、试剂盒内容
PVDF96孔板,室温保存;0.1 ml捕获抗体,4℃保存;0.1 ml生物素标记检测抗体,4℃保存;15 ul亲和素碱性磷酸酶标,4℃保存;0.25 g牛血清白蛋白,4℃保存;0.25 g脱脂乳,4℃保存;11 ml底物缓冲液,4℃保存;11 ml浓缩PBS(10X),室温保存;11 ml浓缩洗涤液(200x),室温保存。
二、试剂的准备 1. 10 ml磷酸缓冲盐(PBS,10X)以90 ml蒸馏水稀释; 2. 0.22 g脱脂乳用11 ml稀释的PBS溶解,最终浓度为2%; 3. 0.22 g BSA溶解于22 ml已稀释的PBS,最终浓度为1%; 4. 10 ml浓缩洗涤液(200x)以1990 ml蒸馏水稀释; 5. 10 ul亲和素碱性磷酸酶以10 ml PBS-1%,BSA稀释; 6. 7 ml酒精以3 ml蒸馏水稀释,最终浓度为70%。 三、Eli-spot操作过程
1. 用100 ul 70%酒精孵育PVDF孔板,室温下孵育10分钟。
2. 倒去酒精,用100 ul PBS洗涤3次。
3. 将100 ul捕获抗体加入10 ml PBS中,混合, 每孔加100 ul, 盖上板盖,4℃过夜。
4. 倒去液体,100 ul PBS洗涤一次。
5. 每孔加入100 ul 2%脱脂乳PBS(见试剂准备),盖上板盖,室温下孵育2小时。
6. 在水槽边和吸水纸上轻打,倒去液体。
7.用100ul PBS洗涤一次。
8. 每孔加入100 ul细胞悬浮液(含适当量的细胞和相应浓度的刺激剂)。细胞可预先在体外接受刺激(间接Eli-spot)。盖上标准的96孔板塑料板盖,37℃ CO2孵育箱中孵育一定的时间(15-20小时)。这期间不要晃动或移动孔板。
9. 在水槽边和吸水纸上轻打,倒去液体。
10. 每孔加100 ul洗涤缓冲液,4℃孵育10分钟。
11. 用100 ul洗涤缓冲液洗孔3次。
12. 于10 ml PBS-1%BSA中稀释100 ul检测抗体,此为一板的量。每孔加100 ul此液体,盖上板盖,37℃下孵育1小时30分。
13. 倒去液体,用100 ul洗涤缓冲液洗3次。
14. 每板以10 ml PBS-1%BSA稀释10 ul的亲和素碱性磷酸酶。每孔加入100 ul此液体,盖上板盖,37℃孵育1小时。
15. 倒去液体,用100 ul洗涤缓冲液洗3次。在吸水纸上拍打,吸干残留的洗涤液。
16. 每孔加入100 ul BCIP/NBT。
17. 室温下反应5-15分钟。完全显色后,将此液倒于相应的盘中。
18. 用蒸馏水充分洗涤膜的两边。吸水纸上轻拍,使膜干燥。保存时,将板倒置以免残留的液体流回膜上一旦膜干燥后,读取点数。4℃下放置一夜,点会比较明显。
此板在室温下避光保存。使用时应注意BCIP/NBT缓冲液是潜在的致癌物质,试验时带手套,使用后适当处理。对MAIPAN4510板,孵育时由于毛细作用,试剂渗入膜中,此液体难以洗去,因此导致背景增加。为了避免此情况,建议在步骤12时将板底移去,将膜倒转,用蒸馏水流冲洗,同时用洗涤缓冲液按正常的步骤洗涤。在步骤14中,由于板底已移去,建议将MAIP4510板放于空的96孔板上,其后的步骤不变。
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其他 | 一、酶联免疫斑点技术(ELISPOT)简介
随着酶联免疫分析技术在医学及生物学领域的广泛应用,使体外检测各种细胞因子及抗体研究有了新的突破。在研究免疫应答机制时以往常用用酶联免疫吸附法(ELISA)检测体液中游离的细胞因子(CK)或抗体,但由于游离的循环抗体或CK的半哀期不同,使之在体液中不断的被代谢或与靶器官结合,而不能确切的反映体内的抗体及CK的水平。80年代,国外的科研工作者根据ELISA技术的基本原理,建立了体外检测特异性抗体分泌细胞和CK分泌细胞的固相酶联免疫斑点技术(ELISPOT)。因其具有较高的特异性和敏感性,目前正被国内外广泛应用,对探索自身免疫系统疾病发病机制具有重要意义。
ELISPOT法源自ELISA,又突破传统ELISA法,是定量ELISA技术的延伸和新的发展。两者都是检测细胞产生的细胞因子或其他可溶性蛋白,它们最大的不同在于:
1. ELISA通过显色反应,在酶标仪上测定吸光度,与标准曲线比较得出可溶性蛋白总量。
2. ELISPOT通过显色反应,在细胞分泌这种可溶性蛋白的相应位置上显现清晰可辨的斑点,可直接在显微镜下人工计数斑点或通过ELISPOT分析系统对斑点进行计数,1个斑点代表1个细胞,从而计算出分泌该蛋白的细胞的频率。(某些研究不仅要测细胞因子生成量,还需检测分泌此细胞因子的细胞频率)
3. 由于是单细胞水平检测,ELISPOT比ELISA和有限稀释法等更灵敏,能从 20万-30万 细胞中检出 1个 分泌该蛋白的细胞。
4. 捕获抗体为BD、R&D、Mabtach生产的高亲和力、高特异性、低内毒素单抗,在研究者以刺激剂激活细胞时,不会影响活化细胞分泌细胞因子。
二、直接的和间接的Eli-spot法
可在已包被抗体的孔中直接刺激细胞(直接法),或在24孔板或烧瓶中先刺激细胞,然后放入已包被的孔中(间接法)。使用哪种方法基于:1)检测细胞的类型;2)希望得到的细胞量。如果只需少量的细胞因子生成细胞,使用直接法;如果细胞因子生成细胞较多,最好使用间接法。其它步骤一致。
刺激方法:建议用PMA和娄诺霉素刺激PBMC,使其产生IFNγ。在培养液中稀释PBMC(如:RPMI 1640加2 mM谷氨酸盐和10%加热失活的小牛血清),其中含1 ng/ml PMA和500 ng/ml娄诺霉素(Sigma, Saint Louis, MO)。加2×104至5×104个细胞到抗体包被的PVDF孔,孵育箱中孵育10-15小时。其它的刺激剂孵育时间可能不同,基于细胞因子生成细胞的量,按不同情况作最佳选择。
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