关键词: 支原体 污染 特点 检验
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我们实验室所有细胞都有支原体污染,而且从上个学期以来越来越严重了。本来上个学期细胞生长还比较快,而实验室负责细胞房管理和复苏细胞、配培基的老师看了以后也总说没关系,因此一直没在这事上下工夫,细胞长得太糟我就用D-Hanks洗两次,然后用酶消化后用灭菌的离心管洗细胞、1000rpm离心,三次,同时用D-Hanks洗两次培养瓶,重新贴壁,似乎也有一点点效果。但这个学期要用的几种细胞中有的过了两个星期也长不起来,长起来的细胞周围也有很多沙子样的小黑点,全实验室所有养了细胞的都说自己的细胞长得差,负责细胞房工作的老师复苏了一次又一次,这方面的问题还是没有人着手解决,我急了,查了支原体方面的文献,有些文章比较麻烦,注射到小鼠体内来杀灭支原体,至少这在我们实验室是不可能使用的方法;有些文章是联合使用两种抗生素来清除支原体,简单方便,我就试了这种。
关于检验支原体污染,有PCR法、培养法、DNA荧光染色法,我选择的是DNA荧光染色法,将冰醋酸和甲醇按1:3混合,固定细胞两次,每次10分钟,然后用1μg/ml的Hoechst33258染色20分钟,紫外激发,确认了我的细胞中生长最好的都有支原体污染。于是我花1.5元买了环丙沙星(ciprofloxacin)药片,稀释成50μg/ml,离心去除淀粉之类的不溶性辅料,加入培基中,稀释成10μg/ml,跟正常培基一样用法,打算处理12天后再用Hoechst33258染色验证,对于污染严重的再用1μg/ml四环素处理3天。我前两天试的,每种细胞分成两瓶,一瓶用加ciprofloxacin的培基,一瓶不加,对比明显,效果不错,但要完全消除还需要一些天。我向同学推荐了这个方法,有人说自己的培基前段时间已经加了青霉素,但好象没有效果,支原体没有细胞壁,这类干扰细胞壁合成的抗生素当然对其没有效果;有的同学试了,细胞变得漂亮多了,原来牢牢贴在瓶壁上的黑点也去掉了。呵呵,俺的那些细胞现在是越长越标致了。
下图是支原体污染细胞的Hoechst33258染色结果。
细胞一旦污染支原体,留之又不能,弃之又可惜,所以总要想一些补救措施,现将我所知道的与各位交流一下。 1)化学药物——在上面讲了很多了 2)抗血清处理——特异性多抗 3)6-甲基嘌呤脱氧核敢(6-MPDR)有限稀释法 4)激活巨噬细胞的应用——可在24孔板内每孔加入1ml饲养细胞20万/ml,使形成巨噬细胞单层,再加入所培养的细胞。巨噬细胞培养基中加入四环素、红霉素、tylosin或林可霉素等抗生素,可消除污染 5)克隆法——有限稀释法,是将细胞稀释接种96孔板中,使每孔接种一个细胞,挑取无污染的单个克隆,此法对污染较轻的细胞株有比较好的效果。 6)加热法——利用软琼脂技术,50度加热灭活细胞的支原体,再于37度1-3天培养,使琼脂中的抗生素与支原体进一步作用。 7)小鼠体内传代除去支原体污染——被支原体污染的特异性杂交瘤细胞可接种鼠腹腔中传代,待长出肿瘤后取出接种小鼠,如此反复2-3次,可有效清除。这种方法在实际单抗制备杂交瘤污染时特别适用。
zxcvbmumu试过了,使用终浓度为10ug/ml的乳酸环丙沙星注射液,可以抑制细胞间的黑点,并使细胞恢复增殖活性,但是好像不能完全去除黑点,谢谢前面讲这一方法的所有发帖者!
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