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一、细胞培养基础和步骤
细胞培养基大全
细胞原代培养步骤
细胞传代培养步骤
二、细胞培养常见问答
1、加到培养基中的血清 必须灭活吗?答:不是必须的,看做什么实验了。
答:如果用于培养大多数的肿瘤细胞,血清一般是不需要灭活的,这样可以有效保存血清中的生长因子 。但是如果用于培养一些表面具有补体受体的细胞,如内皮细胞,血清是需要灭活,一般是56 ℃,30 min。
3、我要做滋养细胞培养,胎牛血清要灭活吗?
答:进口的一般都已灭活,国产的不一定,最好还是灭活一下再用较安全。
答:血清一定要灭活,可以先用无血清培养基加病毒孵育几小时以后再加血清。避免杂蛋白对病毒和宿主结合过程的干扰,一般是2-6小时,根据细胞的状态决定。血清不一定需要灭活,灭活的目的是将血清中的补体灭活!这要根据实际情况而定,如果没有把握那就灭活吧,也不麻烦56度半个小时。
答:关于血清的热灭活,是很多人感兴趣也存在一定争议的话题。大多数实验室将血清的热灭活还是作为常规来执行,因为有两个作用,第一是灭活补体,第二是灭活血清中可能存在的支原体。但是实验者并没有考虑热处理对血清中的生长因子 、氨基酸 等成分带来的负面影响。
我在实验室处理血清的时候,有一次水浴 箱在灭活过程中出现故障,温度升高到80 ℃,血清变成了凝胶状,我重新处理了另外一份血清,将两份血清对比,发现高温直接影响到血清所含的抗体蛋白。在56 ℃下灭活半小时以上,肯定也会对里面的蛋白起到破坏作用。下次有机会我做个延长灭活时间的实验试试,看看到底有多大的影响。热灭活之后,血清放在四度冰箱久了,就会有沉淀产生,这常常会被认为是微生物污染或者是黑胶虫污染。为了验证到底有没有污染,常常又会把血清放置37 ℃温育,但是血清中的蛋白会进一步析出,最后还是要做镜检,无菌培养试验,和革兰氏染色试验,非常麻烦。
我看过一份资料,里面提到70%的实验者认为灭活是理所当然的。常规灭活建议的温度在45 ℃到62 ℃之间,而时间则从15分钟到60分钟不等。其中最常用的手法是56℃热处理30分钟。随着血清采集、处理、加工工艺的提高,许多早先认为是热灭活的原因已经不再成立,只有少数对血清进行热灭活的研究者在实验中证实了这一步骤的有效性和必要性。
有人比较过11个不同细胞株,发现其中热灭活对6 个细胞株(HBAE,MDBK,Vero,成纤维细胞,MRC-5)的生长带来负面影响,三个细胞株(FOX-NY,MDCK和CHO-K1)不受热灭活的影响,而只有两个细胞株(Balb/3T3,Sp2/0Ag14 hybrid),在热灭活之后,细胞生长有轻微的改善。所以,在正常的操作下,热灭活通常对细胞的生长没有明显的促进作用。
你可以摸索一下,血清从-20 ℃冰箱拿出来之后在常温解冻,然后混匀分装成两份,一份灭活,一份不灭活,比较这两种血清对细胞是否有影响。然后再确定是灭活还是不灭活。这个过程最多也就一个星期。同时你还要考虑血清灭活与否对你后续的实验有没有影响。
答:正常。
6、如何选用培养基?
加热可以灭活补体系统。激活的补体参与溶解细胞事件,刺激平滑肌收缩,细胞和血小板释放组胺,激活淋巴细胞和巨噬细胞。在进行免疫学研究、培养ES细胞、昆虫细胞和平滑肌细胞时,推荐使用热灭活血清。
L-谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后,L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解,但是确切的降解率一直没有最终确定。L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成,而氨对于一些细胞具有毒性。
GlutaMAX-I二肽是L-谷氨酰胺的衍生物,将其不稳定的α-氨基用L-丙氨酸来保护。一种肽酶逐渐裂解二肽,释放L-谷氨酰胺供利用。 GlutaMAX-I二肽非常稳定,即使在121磅灭菌20分钟,GlutaMAX-I二肽溶液有最小的降解,如果在相同条件下,L-谷氨酰胺几乎完全降解。
酚红在培养基中被用来作为PH值的指示剂:中性时为红色,酸性时为黄色,碱性时为紫色。研究表明,酚红可以模拟固醇类激素的作用(特别是雌激素)。为避免固醇类反应,培养细胞,尤其是哺乳类细胞时,用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测,一些研究人员在做流式细胞检测时,不使用加有酚红的培养基
用无血清培养基把细胞悬液稀释到200-2 000个/毫升,在0.1毫升的细胞中加入0.1毫升的0.4%的台盼兰溶液。轻轻混匀,数分钟后,用血球计数板计数细胞。活细胞排斥台盼兰,因而染成蓝色的细胞是死细胞。
7 )在无抗生素的培养基中培养4-6代,确定污染是否以已被消除。
丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源。尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源,但是,如果没有葡萄糖的话,细胞也可以代谢丙酮酸钠。
GIBICO的胎牛血清 没有预老化,储存在2-8 ℃时,血清中的各种蛋白和脂蛋白(如冷凝集素、纤维蛋白原、玻粘连蛋白等)可能聚集而形成沉淀或可见的混浊。这应该不会影响血清的质量。推荐在-20 ℃储存胎牛血清,避免反复冻融。
HBS和 EBS 的主要差别在于碳酸氢钠的水平,碳酸氢钠的含量在Eagles (2.2 g/L)中比在Hanks (0.35 g/L) 中高。碳酸氢钠需用高水平的CO2平衡,以维持溶液的PH值。Eagles液在空气水平的CO2 中,溶液会变碱,Hanks液在CO2培养箱中会变酸。如果希望在CO2培养箱中保存组织,需要用Eagles液。如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织,用Hanks液就可以了。
Certified 胎牛血清包括了Qualified 胎牛血清执行的所有的标准检验程序,而且除了这些标准检测,Certified胎牛血清还有如下一些附加的检测: End-Point Determination of Endotoxin Content 噬菌体检验 生物化学检测 激素的检测 血红蛋白检测 Sf9 细胞生长促进及方法学检测
二价离子的确抑制胰蛋白酶活性。EDTA用来螯合游离的镁离子和钙离子,以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建议胰蛋白酶处理细胞前,用EDTA清洗细胞,以消除来自培养基中所有的二价离子。
是的。对于LIPOFECTAMlNE Reagent,稀释试剂在100 μl OPTI-MEM中,稀释DNA在100μl OPTI-MEM中。混合两种溶液在室温下孵育15分钟。对于LIPOFECTIN Reagent,在加入DNA溶液前允许稀释的试剂和培养基孵育至少30分钟可以增加3倍的效率。确保复合物在没有血清的情况下形成。孵育15分钟后,在复合物中加入含有血清的培养基(800 μl)。(注意以上是35 mm培养皿使用体积)。对于LIPOFECTAMlNE Plus Reagent DNA应该在与脂质体混合之前首先与Plus Reagent混合。LIPOFECTAMlNE 2000的操作步骤允许在一个很小的体积下混合DNA和脂质体,接下来可以不需要换培养基的情况下直接加入。对于每一种脂质体的详细的信息可以参考产品说明书。
如果目的蛋白是一个后期蛋白,它将与蛋白酶一起表达,这些蛋白酶将会作用于目的蛋白。在加有血清的培养基中,这些蛋白酶将作用到血清中的蛋白,从而使目的蛋白产品保持完好。在无血清配方中,蛋白酶作用的唯一底物是你的目的蛋白。为了避免这一问题,加入一些蛋白酶抑制剂或加入少量的血清(少于1%),让血清给蛋白酶提供作用底物。
LAL(Limulus Amebocyte Lysate)试验是可用的最敏感和特异的检测细菌内毒素的方法。Levin和Bang 发现细菌可引起鲎(Limulus polyphemus)血管内的凝集作用。内毒素启动一个细胞内酶原系统(丝氨酸蛋白酶级联反应系统),通过修饰凝集素,产生一种透明的胶,LAL中的凝固蛋白,从而,形成不可溶的基质。LAL试剂缓冲的鲎(血细胞)裂解物。 胎牛血清的内毒素检测是在Grand Island,按照手册上Gel-clot 方法进行的。在对血清产品进行内毒素检测前,用无热源的水1:10稀释样品。稀释样品沸水育5分钟,以消除抑制剂。(通常,血液中的内毒素结合成份的出现会抑制凝胶过程,使内毒素不能与LAL反应。样品预先热处理可以消除这种抑制作用。)
如果使用固体形式的培养基,需要加入琼脂。琼脂加入前要先灭菌。应该避免MS培养基的直接灭菌,应该高压灭菌琼脂溶液,然后把融化的琼脂溶液加入到MS培养基中。
生长培养基的PH值对细胞的增值和病毒或重组蛋白的生产均会产生影响。对于大部分鳞翅类昆虫细胞系,在PH值 6.0-6.4范围的大部分应用效果良好。培养鳞翅类昆虫细胞系时,培养基的最适渗透压是 345-380 mOsm/kg.。为保证可靠和持久的细胞培养方式,减少技术问题,保持PH值和渗透压在以上所列的范围之内。
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