3.EMSA 胶的配制:
(1)准备好倒胶的模具。可以使用常规的灌制蛋白电泳胶的模具,或其它适当的模具。最好选择可以灌制较薄胶的模具,以便于干胶等后续操作。为得到更好的结果,可以选择可灌制较大 EMSA 胶的模具。
(2)按照如下配方配制20毫升4%的聚丙烯酰胺凝胶(注意:使用29:1等不同比例的Acr/Bis对结果影响不大)。
TBE buffer (10X)1毫升
重蒸水 16.2毫升
39:1 acrylamide/bisacrylamide (40%,w/v)2毫升
80% 甘油 625微升
10% 过硫酸铵 (ammonium persulfate)150微升
TEMED 10微升
(3)按照上述次序加入各个溶液,加入TEMED前先混匀,加入TEMED后立即混匀,并马上加入到制胶的模具中。避免产生气泡, 并加上梳齿。如果发现非常容易形成气泡,可以把一块制胶的玻璃板进行硅烷化处理。
4.EMSA结合反应:
(1)如下设置EMSA结合反应:
阴性对照反应:
Nuclease-Free Water 7微升
EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X)2微升
细胞核蛋白或纯化的转录因子 0微升
标记好的探针 1微升
总体积 10微升
样品反应:
Nuclease-Free Water 5微升
EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X)2微升
细胞核蛋白或纯化的转录因子 2微升
标记好的探针 1微升
总体积 10微升
探针冷竞争反应:
Nuclease-Free Water 4微升
EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X)2微升
细胞核蛋白或纯化的转录因子 2微升
未标记的探针 1微升
标记好的探针 1微升
总体积 10微升
突变探针的冷竞争反应:
Nuclease-Free Water 4微升
EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X)2微升
细胞核蛋白或纯化的转录因子 2微升
未标记的突变探针 1微升
标记好的探针 1微升
总体积 10微升
Super-shift反应:
Nuclease-Free Water 4微升
EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X)2微升
细胞核蛋白或纯化的转录因子 2微升
目的蛋白特异抗体 1微升
标记好的探针 1微升
总体积 10微升
(2)按照上述顺序依次加入各种试剂,在加入标记好的探针前先混匀,并且室温(20-25℃)放置10分钟,从而消除可能发生的探针和蛋白的非特异性结合,或者让冷探针优先反应。然后加入标记好的探针,混匀,室温(20-25℃)放置20分钟。
(3)加入1微升EMSA/Gel-Shift上样缓冲液(无色,10X),混匀后立即上样。注意:有些时候溴酚蓝会影响蛋白和DNA的结合,建 议尽量使用无色的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液。如果对于使用无色上样缓冲液在上样时感觉到无法上样,可以在无色上样缓冲液里面添加极少量的蓝色的上样缓冲液,至能观察到蓝颜色即可。
5.电泳分析:
(1)用0.5XTBE作为电泳液。按照10V/厘米的电压预电泳10分钟。预电泳的时候如果有空余的上样孔,可以加入少量稀释好的1X 的EMSA上样缓冲液(蓝色),以观察电压是否正常进行。
(2)把混合了上样缓冲液的样品加入到上样孔内。在多余的某个上样孔内加入10微升稀释好的1X的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液 (蓝色),用于观察电泳进行的情况。
(3)按照10V/厘米的电压电泳。确保胶的温度不超过30℃,如果温度升高,需要适当降低电压。电泳至EMSA/Gel-Shift上样缓 冲液中的蓝色染料溴酚蓝至胶的下缘1/4处,停止电泳。
(4)剪一片大小和EMSA胶大小相近或略大的比较厚实的滤纸。小心取下夹有EMSA胶的胶板,用吸水纸或普通草纸大致擦干胶板边 缘的电压液。小心打开两块胶板中的上面一块(注:通常选择先移走硅烷化的那块玻璃板),把滤纸从EMSA胶的一侧逐渐覆盖住整个EMSA胶,轻轻把滤纸和胶压紧。滤纸被胶微微浸湿后(大约不足1分钟),轻轻揭起滤纸,这时EMSA胶会被滤纸一起揭起来。把滤纸侧向下,放平,在EMSA胶的上面覆盖一层保鲜膜,确保保鲜膜和胶之间没有气泡。
(5)干胶仪器上干燥EMSA胶。然后用X光片压片检测,或用其它适当仪器设备检测。