关键词: RNA RNA提取
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1. 使用正确的细胞或组织储存条件
在样品用液氮瞬间冻结之后,应该储存在-80℃,千万不能解冻。即使是置于含有胍盐的裂解液中作匀浆前的短暂解冻,也会导致RNA的降解和损失。瞬间冻结的组织应该首先在超低温条件下先研磨成粉,然后置于裂解液中进行匀浆。
RNAfixer使样品储存更为便利。储存在RNAfixer中的细胞或组织可在室温下稳定保存长达1个星期,在4℃可稳定保存长达1个月,或永久保存在-20℃。
2. 消除环境RNase的污染
为了得到完整的、高品质RNA,在整个RNA制备过程中,当RNA离开强蛋白变性剂(如离液裂解液或酚)的保护时,避免引入新的RNase污染就非常关键。由于RNase几乎是无所不在,所以必须确保与纯化的RNA接触的每一样东西都是无RNase污染的。所有的表面,包括移液器、工作台、玻璃器皿和制胶设备,都必须用表面去污净化溶液如RNase喷雾清除剂 来处理过,去除各种溶液或者反应缓冲液中可能存在的RNase污染,可以用RNAsafe.必须保证一直使用无RNase的枪头、试管和溶液,手套也应经常更换。
3.迅速灭活内源的RNA酶,以防止RNA降解
以下3个方法均可有效使内源RNA酶失活:
1)用含离液(如胍盐)的细胞裂解液收获样品,并立即匀浆。
2)用液氮瞬间冻结样品。值得特别注意的是:组织块必须保证足够小,在浸入液氮的瞬间就能冻结,以确保瞬间令RNA酶失活。
3)立即将样品置于RNAfixer无液氮RNA样品储存液中。它是一种水相、无毒的收集试剂,能立即稳定并保护完整、未冻结的组织和细胞样品中的RNA.关键要点是组织样品切片一定要够薄(<0.5 cm),这样RNAfixer才能在RNase破坏RNA之前迅速渗入组织块中。
4. 选择合适破壁方法
细胞或组织的彻底匀浆对RNA提取来说,是一个很关键的步骤,它能够防止RNA的损失和降解。匀浆的方法应根据细胞或组织的类型来选择。大部分培养的细胞可以置于细胞裂解液中,通过简单的涡旋震荡来匀浆;而动物组织、植物组织、酵母和细菌、真菌则常常需要更加剧烈的方法,通常用液氮研磨。比如说细菌(特别是革兰氏阳性菌)的细胞壁,就需要溶菌酶消化来实现彻底的细胞裂解和RNA的最大回收,酵母提取时加入破壁酶帮助破壁,再用TRIpure或RNApure进行提取。
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RNA抽提后出现奇怪情况
按步骤用50mg的小鼠肝脏提取总RNA,用预冷的研钵和-70度保存的trizol共研磨组织,氯仿分层,异丙醇沉淀,75%乙醇洗一遍,风干后depc水溶解沉淀,1.5%的琼脂糖电泳220V,20min,结果图如下,各位大神能帮我看看是什么情况吗?
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siRNA转染后目的蛋白没有减低是为什么?
我想用siRNA抑制DMT1,在吉马公司买了三个siRNA,我用的是lipo2000转染,转染前饥饿2h,转染6小时,后换成完全培养基48小时,对照使用转染GAPDH做的,接下来WB检测DMT1,却没有观察到目的蛋白的下降,请问有人遇到过相似的情况吗?应该怎么解决。
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师兄师姐好,我第一次做提取RNA的实验,不知道最后用DEPC水溶解样品时,用多少的DEPC水呢?
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