关键词: 凝胶迁移或电泳迁移率实验 EMSA
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3.EMSA胶的配制:
(1) 准备好倒胶的模具。可以使用常规的灌制蛋白电泳胶的模具,或其它适当的模具。最好选择可以灌制较薄胶的模具,以便于干胶等后续操作。为得到更好的结果,可以选择可灌制较大 EMSA 胶的模具。
(2) 按照如下配方配制20毫升4%的聚丙烯酰胺凝胶(注意:使用29:1等不同比例的Acr/Bis对结果影响不大)。
TBE buffer (10X) 1毫升
重蒸水 16.2毫升
39:1 acrylamide/bisacrylamide (40%,w/v) 2毫升
80% 甘油 625微升
10% 过硫酸铵 (ammonium persulfate) 150微升
TEMED 10微升
(3) 按照上述次序加入各个溶液,加入TEMED前先混匀,加入TEMED后立即混匀,并马上加入到制胶的模具中。避免产生气泡, 并加上梳齿。如果发现非常容易形成气泡,可以把一块制胶的玻璃板进行硅烷化处理。
4.EMSA结合反应:
(1) 如下设置EMSA结合反应:
阴性对照反应:
Nuclease-Free Water 7微升
EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) 2微升
细胞核蛋白或纯化的转录因子 0微升
标记好的探针 1微升
总体积 10微升
样品反应:
Nuclease-Free Water 5微升
细胞核蛋白或纯化的转录因子 2微升
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