关键词: DNA平端连接 DNA 注意事项
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T4噬菌体DNA连接酶不同于大肠杆菌DNA连接酶,它可以催化平端DNA片段的连接(Sgaramella和Khorana,1972;Sgaramella和Ehrlich,1978),由于DNA很容易成为平端,所以这是一个极为有用的酶学物性。有了这样的物性,才能使任何DNA分子彼此相连。
优点:
1、没有连不上的,只有切不开的。平末端连接不牵扯到粘性末端的碱基突出问题,所以,理论上任何两条DNA序列都能连接在一起,当然需要ligase的酶学作用。这个不同DNA分子之间的连接带来了极大地便利,因为平末端自然是这样,而如果遇到5‘或者3’突出的粘性末端,也可以经过处理成为平末端。
2、有时候,两个平末端连接在一起以后,可以产生另一种内切酶的识别序列,为后续的克隆工作提供了一种机会。
缺点:
1、连接效率比粘性末端低:连接效率之所以比较低,原因之一是在连接过程中只有连接酶的作用,缺乏粘性末端那样突出碱基的互补作用;原因之二是常用的T4DNAligase对于平末端的Km值比粘性末端高1000倍。
2、可能产生双向插入:由于平端连接的末端没有特异性,连接的时候不能定向,所以两种方向的插入都有可能。这个时候就需要有一种有效的鉴定方法。一般分别在载体和目的片段选择一个酶切位点进行酶切鉴定,当然,具体的鉴定方法要根据具体的实验而定。
3、可能多拷贝插入:平端连接时,可能目的片段多个插入,并且在多个插入的时候还有可能每个插入子以不同方向连接,导致有时候结果难以解释。一般目的片段越大,多拷贝插入的可能就越小。
平端连接要求的条件:
1、 低浓度(0.5mmol/L)的ATP(Ferretti和Sgaranekka,1981)。
2、 不存在亚精胺一类的多胺。
3、 极高浓度的连接酶(50Weiss单位.ml)。
4、 高浓度的平端。
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