标签: 二氢硫辛酰胺脱氢酶 氧化 还原 酶学实验手册第三章
NADH:硫辛酰胺氧化还原酶,硫辛酰胺脱氢酶。此酶发现于细胞中,游离形式(二聚体)存在,与多酶复合体结合,与丙酮酸脱氢酶复合体、酮戊二酸脱氢酶复合体以及分支的含氧酸脱氢酶复合体相似。此酶首先被Straub(1939)发现,由于其在加入人为的电子受体如氰化铁、二氯酚吲哚酚和醌后,可以催化NAD(P)H的氧化,由此得名。来源:《酶学实验手册》
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此可逆反应可以从任一方向检测。氧化型硫辛酸和其氨基化合物是可以购买到的,但是利用简单的步骤就可使其还原。硫辛酸和其氨基化合物都可作为底物,有氨基存在,此酶的活性要强 5 倍。
实验所需「试剂」具体见「其他」
0.96 ml 实验混合物
0.02 ml 0.2 mol/L DL-二氢硫辛酰胺 4.0 mol/L
0.02 ml 酶样品
开始加入 0.01 ml 0.1 mmol/L H2O2 溶液
30℃ 时,于 340 nm 处吸收值发生变化,ε340=6.3×103 l/(mol·cm)。
试剂:
0.1 mol/L 磷酸钾,pH7.5
0.1 mol/L NAD(游离酸,Mr=663.4;663 mg 溶于 10 ml 水中)
0.1 mol/L DTE(二硫赤藓糖醇,Mr=154.2;或二硫苏糖醇,DTT,Mr=154.2;154 mg 溶于 10 ml 水中)
0.2 mol/L DL-二氢硫辛酰胺(Mr=207.3;52 mg 溶于 1.25 ml 乙醇或者丙酮。原料溶液浓度的二氢硫辛酰胺不可溶于水中,而且不可溶于酒精。存在醇脱氢酶时,例如天然的乙醇可以与 NAD 反应形成乙醛和 NADH,因此必须排除这个酶的活性,若两者选一,底物必须溶解于丙酮溶液中)。
0.93 ml 实验混合物
0.05 ml 0.2 mol/L DL-二氢硫辛酰胺 10 mol/L
30 ℃ 时,于 340 nm 处吸收值发生变化,ε340=6.3×103 l/(mol·cm)。
0.1 mol/L 磷酸钾,pH 7.5
0.1 mol/L NAD+(游离酸,Mr=663.4;663 mg 溶于 10 ml 水中)
0.01 mol/L NADH(二钠盐,Mr=709.4,71 mg 溶于 10 ml 水中)
0.1 mol/L EDTA(Mr=292.2;292 mg 溶于 10 ml 水中)
0.2 mol/L DL-硫辛酰胺(6,8-硫辛酰胺,Mr=205.3;51 mg 分别溶于 1.25 ml 乙醇或者丙酮中)
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