标签: 歧化作用 PDHC 总活性 酶学实验手册第三章
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0.98 ml 实验混合物
0.02 ml 酶样品
30 ℃ 培养 15 min 后将样品放于冰中,然后加入 0.2 ml 2 mol/L 羟胺。
室温放置 10 min 后加入 0.6 ml FeCl3 试剂
离心 5 min,以缓冲液取代酶样品为空白对照于 546 nm 测量吸收值。
计算
试剂:
0.1 mol/L 磷酸钾,pH 7.6
0.1 mol/L MgCl2(MgCl2·6H2O,Mr=203.3;203 mg 溶于 10 ml 水中)
0.1 mol/L 丙酮酸(丙酮酸钠,Mr=110.0;110 mg 溶于 10 ml 水中)
0.01 mol/L 二磷酸硫胺(脱羧辅酶,Mr=460.8;46.1 mg 溶于 10 ml 水中)
0.1 mol/L 二硫赤藓糖醇(DTE,Mr=154.2,或二硫苏糖醇、DTT,Mr=154.2;154 mg 溶于 10 ml 水中)
0.01 mol/L 辅酶 A(游离酸,Mr=767.5,CoA·Li3,Mr=785.4;23 mg 溶于 3 ml 水中)
0.1 mol/L NAD+(游离酸,Mr=663.4;663 mg 溶于 10 ml 水中)
磷酸转乙酰酶(4000 U/ml)
乳酸脱氢酶(10 000 U/ml)
2 mol/L 羟胺(等量的 4 mol/L 氯化羟胺,Mr=69.49 和 4 mol/L KOH,Mr=56.11 混合)
FeCl3 试剂
100 ml 5% FeCl3(8.33 g FeCl3·6H2O,Mr=270.3,用 0.1 mol/L HCl 补充至 100 ml)
100 ml 12% TCA(三氯乙酸,Mr=163.4)
100 ml 3mol/L HCl(1:3 的比例混合 HCl 和 H2O)
将三种溶液混合
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