标签: 酶联免疫 吸附 ELISA 微生物学实验第三版第十七章
酶联免疫吸附试验(enzyme-linkedimmunosorbentassay,简称ELISA)是免疫酶技术的一种,是将抗原抗体反应的特异性与酶反应的敏感性相结合而建立的一种新技术。来源:《微生物学实验(第三版)》
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实验所需「试剂」具体见「其他」
1. 包被抗原
用套有橡皮吸头的 0.2 ml 吸管小心吸取用包被液稀释好的抗原,沿孔壁准确滴加 0.1 ml 至每个塑料板孔中,防止气泡产生,置 37℃ 过夜。
2. 清洗
快速甩动塑料板,倒出包被液。用另一根吸管吸取洗涤液,加入板孔中,洗涤液量以加满但不溢出板孔为宜。室温放 3 min,甩出洗涤液。再加洗涤液,重复上述操作三次。
3. 加血淸
用三根套有橡皮吸头的 0.2 ml 吸管,小心吸取稀释好的血淸(待检、阳性、阴性血清),准确加 0.1 ml 于对应板孔中,第 4 孔中加 0.1 ml 洗涤液,37℃ 放置 10 min 在水池边甩出血清,洗涤液洗三次(方法同上)。
4. 加酶标抗体
用吸管沿孔壁上部小心准确加入 0.1 ml 酶标抗体(不能让血清沾污吸管),37℃ 放置 10 min,同上倒空,洗涤三次。
5. 加底物
按比例加 H2O2 于配制的底物溶液中,立即用吸管吸取此种溶液,分别加于板孔中,每孔 0.1 ml。 置 37℃,显色 5~15 min(经常观察),待阳性对照有明显颜色后,立即加一滴 2 mol/L H2SO4 终止反应。
6. 判断结果
肉眼观察(白色背景),阳性对照孔应明显黄色,阴性孔应无色或微黄色,待测孔颜色深于阳性对照孔则为阳性;若测光密度,酶标测定仪取 λ=492nm,P/n>2.1 时阳性,P/n<1.5 阴性,2.1>P/n>1.5可疑阳性,应予复査,P/n=(检测孔 O.D. 值)/(阴性孔 O.D. 值)(用空白孔校 T=100%)。
滴加试剂量要准,且试剂不可从一孔流到另一孔中,每种试剂对应一种吸管,不能混淆,底物溶液中的 H2O2 要临时用再加。否则,放置时间过长,底物被氧化为黄色,影响试验结果判定。
在操作过程中切记溢出互混。
试剂:
1. 包被液(0.05 mol/L pH 9.6 碳酸盐缓冲液):甲液:Na2CO3,5.3 g/L,乙液:NaHCO3,4.2 g/L,取甲液 3.5 份加乙液 6.5 份混合即成,现用现混。
2. 洗涤液(吐温酸盐缓冲液 pH 7.4):NaCl 8 g,KH2PO4 0.2 g,Na2HPO4·12 H2O 2.9 g,KCl 2 g,吐温 20 0.5 ml,蒸馏水加至 100 ml。
3. pH 5.0 磷酸盐-柠檬酸缓冲液:柠檬酸(19.2 g/L)24.3 ml,0.2 mol/L 磷酸盐溶液(28.4 g Na2HPO4/L)25.7 ml 两者混合后再加蒸馏水 50 ml。
4. 底物溶液:100 ml pH 5.0 磷酸盐—柠檬酸缓冲液加邻苯二胺 40 mg 用时再加 30% H2O2,0.2 ml。
5. 终止液 2 mol/L H2SO4。
6. 酶结合物冻存液的母液:0.02mol/L PBS pH 7.4,即(1)K2HPO4·3H2O 1.83 g 加蒸馏水至 400 ml,(2)Na2HPO4·2H2O,312 g,加蒸饱水至 100 ml,(1):(2)=81:19 混合。
7. 应用液:0.02mol/L PBS pH 7.4,60 ml+40 ml 甘油+万分之一的疏柳汞(也可不加)配成 40% 甘油液,即为酶结合物冻存液。
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