1. 对于贴壁培养的单层细胞:
1.1 感染 CV-1 贴壁单层细胞:在病毒感染前一天,用完全 MEM-10 培养基将 5 × 105 细胞/孔加入 6 孔组织培养板培养,直至细胞几乎汇片生长(一般过夜)。
1.2 胰酶消化病毒储液。每份病毒储液加入等体积的 0.25 mg/ml 胰酶,涡旋混匀,温育 30 min,每隔 5~10 min 晃动一次。 MOI 为 10 pfu/细胞可以获得高水平的蛋白质表达。 如果还有团状物,将其冷却到 0℃,冰上超声 30 s。可以重复几次超声,但超声的间隔中样品应当置冰上冷却(见本实验「重组痘苗病毒(VTF7-3)感染后的脂质体转染」)。
1.3 将两种胰酶消化的病毒储液混合。
1.4 将胰酶处理后的病毒用 MEM-2.5 培养基稀释至 4 × 107 pfu/ml (每种病毒为 2 × 107 pfu/ml)。
1.5 吸出培养基,用 0.5 ml 的病毒混合液感染 6 孔板中每孔的细胞,温育 1~2 h,每隔 15~30 min 晃动一次。
1.6 加入 2 ml 的 DMEM-10 培养。根据使用的方法,在感染后 5~24 h 分析基因表达。如果纯化蛋白质,在感染 2~3 天后收获细胞。 注:尽管在感染后数小时就可以检测基因表达,但一般在病毒感染的晚期进行免疫沉淀、免疫印迹或 Northern 印迹分析,因为这时 T7 控制的基因产物积聚到最高水平。早期分析一般检测表达蛋白的生物学活性。
2. 对于悬浮培养的细胞:
2.1 感染 HeLa S3 悬浮细胞:在病毒感染前,用血球计数器对细胞进行计数, 在室温下 1800 g 离心 5 min,弃上清。用转瓶 MEM-5 培养基重悬细胞至 2 × 107 细胞/ml,将其转移到较小的无菌组织培养瓶或 Erlenmeyer 瓶中。
2.2 胰酶消化病毒储液。每份病毒储液加入等体积的 0.25 mg/ml 胰酶,涡旋混匀,温育 30 min, 每隔 5~10 min 晃动一次。 MOI 为 10 pfu/细胞可以获得高水平的蛋白质表达。 如果还有团状物,将其冷却到 0℃, 冰上超声 30 s。可以重复几次超声,但超声的间隔中样品应当置冰上冷却(见本实验「重组痘苗病毒(VTF7-3)感染后的脂质体转染」)。
2.3 将两种胰酶消化的病毒储液混合。
2.4 将胰酶消化病毒混合物加入浓缩细胞中,37℃ 悬浮培养。
2.5 将感染后的细胞加入到大的旋转培养瓶中,用转瓶 MEM-5 培养基将其稀释至 5× 105 细胞/ml,37℃ 悬浮培养 1~3 天。
2.6 收获细胞,分析或纯化表达蛋白(见步骤 1.6 注释)。
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