实验前准备详见「其他」。
1. 用完全 DMEM-10 培养基培养细胞。转染前一天,用完全 DMEM/tet 培养基接种适量的细胞于 10 cm 组织培养皿中,使在转染时细胞生长至 1/3 汇片。 此后,细胞的培养都要含 0.5 μg/ml tet。 每次转染需要一个培养皿。一个典型的实验应该包括 tTA 对照培养皿、tTA 和靶基因对照培养皿,以及非转染对照培养皿。 2. 转染之前使质粒线性化,调节质粒浓度>0.5 mg/ml。
3. 用 500 μl HeBS 在干净的 4 ml 聚苯乙烯管混合 10~20 μg 的 pTet- tTAK (带或不带等摩尔数的目的基因质粒)和 1~2 μg pSV2-His (每一 tet 质粒与 带选择标记质粒的摩尔数比例为 10:1)。 设立无 DNA 的转染对照。在含 125 μmol/L L-组氨醇的选择培养基中(步骤 14),所有无 DNA 转染的细胞都应死亡。
4. 向质粒 DNA 中加入 32.5 μl 2 mol/L 的 CaCl2,立即轻轻振荡混匀。间歇轻轻振荡,在室温放置 15~30 min 让沉淀生成,或直至与装水的管相比有明显混浊。
5. 将培养基从细胞中吸出,一次做一个板子。用巴斯德枪头抽吸几次混匀沉淀,逐滴均匀地覆盖所有细胞。
6. 温育 30 min,15 min 后轻轻振摇平板,以确保均匀覆盖整个板子。
7. 仅对第一轮:每一平板加 10 ml 含或不含 25 μmol/L 氯喹(终浓度)的完全 DMEM/tet 培养基。 尽管氯喹在用甘油休克处理时会进一步减少细胞的完整性(步骤 9),但它能增加转染的效率。
8. 温育 4~5 h。
9. 轻轻地将培养基吸出,尽量不要触及位于细胞上的沉淀。逐滴加入 2.5 ml 预热的 85% HeBS/15% 甘油,休克处理细胞。 在甘油休克处理细胞前,特别是休克处理后看到细胞碎片是正常的现象。根据研究者操作的速度,可以同时休克处理 2~4 块板子。
10. 2.5 min 后将 HeBS/甘油吸出。快速操作,因为甘油对细胞的毒性很大。 根据不同的细胞类型,细胞暴露在甘油溶液中的时间长短是可以调节的,可以延长到 4~5 min 以得到最佳的转染效率。在导致最少细胞死亡的情况下应休克处理更长的时间。
11. 轻轻地、快速地清洗细胞 2 次,每次加入 10 ml 完全的 DMEM/tet, 然后立即吸出。 由于在加入甘油之后,培养皿中的细胞易脱落,将所有的培养基加到培养皿中的一个点上。
12. 加入 10 ml 的 DMEM/tet 完全培养基,温育过夜。
13. 转染后的第 2 天早上,吸出培养基,加入 10 ml DMEM/tet 完全培养基,继续温育。
14. 转染后 48 h,用含 125 μmol/L L-组氨醇的选择培养基将细胞在 10 cm 培养板稀释,在每个 10 cm 培养板上接种 3×104~1×106 细胞。多制备几块中间浓度的细胞培养板,也就是说,接种细胞浓度相当于生长接近汇片的培养板的 1 : 16~1 : 32。
15. 4 天后用含 125 μmol/L L-组氨醇的选择培养基培养细胞。当克隆形成后,将选择培养基中 L-组氨醇的浓度增加至 250 μmol/L。 L-组氨醇对于细胞是有毒性的。选择培养基中 L-组氨醇的浓度开始应保持在较低的水平,当大量的细胞高水平表达 PSV2-His 时再增加 L-组氨醇的浓度。
16. 当克隆形成完好(选择 12~14 天),环绕克隆四周做个标记。从培养皿中吸出培养基,将一个塑料克隆环环绕单独克隆放置。用 100 μl PBS 快速冲洗克隆,加 2 滴胰酶(100 μl) 处理 30 s~1 min。 从培养皿中挑选细胞,单独的克隆适度地分布于培养皿上很容易区分。
17. 用一个巴斯德吸管上下吹打将细胞吹散,并把克隆转移到含 1 ml 250 μmol/L L-组氨醇选择培养基的 24 孔板孔中。
18. 当细胞长满时,用 500μmol/L L-组氨醇选择培养基将细胞转移至 6 cm 的组织培养板中。 所有的胰酶消化均按照标准的方法进行,包括快速的 PBS 清洗,1~3 min 的胰酶/ EDTA 温育(每个生长至汇片的 10 cm 的培养板用 2 ml) 和用含 10% 牛血清的 500 μmol/L L-组 氨醇选择培养基稀释终止胰酶消化反应。
19. 将待检测的细胞用 500 μmol/L L-组氨醇选择培养基扩增。将要保存的细胞分装并冻存于液氮中。此后细胞用 500 μmol/L L-组氨醇选择培养基进行培养。检测 tTA 或目的基因的表达或者进行第二轮转染,见「pTet-tTAK 稳定转染(第二轮)」。
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