实验试剂准备详见「其他」。 1. 将重悬的重组噬斑置于含有冰水的杯状超声仪上,以最大的功率超声 20~30 s。
2. 每个噬斑取 250μl (1/2) 感染 12 孔组织培养板中汇片生长的单层细胞。培养 1~2 h,每隔 15 min 轻轻摇动一次。
3. 用 1 ml 含有合适筛选试剂的完全 MEM-2.5 培养基覆盖细胞。
3 .1 对于 XGPRT 筛选,含有 1/400 体积的 10 mg/ml MPA、1/40 体积的 10 mg/ml 黄嘌呤、1/670 体积的 10 mg/ml 次黄嘌呤。
3.2 对于 TK 筛选,含有 1/200 体积 5 mg/ml BrdU。培养 2 天或者直到细胞病变(细胞变圆)明显。
4. 用细胞刮刀轻轻刮下细胞,转移到微量离心管中,最大转速,离心 30 s,弃培养基。
5. 将细胞用 0.5 ml MEM-2.5 培养基重悬。反复冻融法裂解细胞悬液:用干冰/乙醇将细胞冻结,再用 37℃ 水浴及涡旋使细胞解冻。如此进行 3 次。
6. 将重悬的细胞悬液置于冰上,在杯状超声仪上以最大功率超声 20~30 s。
7. 用 0.75 ml 含有筛选试剂的完全 MEM-2.5 培养基(见步骤 2 和 3) 稀释 0. 25 ml 来自步骤 6 的裂解液,感染 25 cm2 组织培养瓶中汇片生长的单层细胞,培养 30 min。
8. 用 4 ml 含有适当筛选试剂的完全 MEM-2.5 培养基(见步骤 3) 覆盖细胞。培养 2 天或者直到细胞病变(细胞变圆)明显。
9. 用细胞刮刀轻轻刮下细胞,转移到 15 ml 锥形离心管中,5~10℃,1800 g 离心 5 min,弃培养基。细胞用 0.5 ml MEM-2.5 培养基重悬。按照步骤 5 和 6 的方法反复冻融法裂解细胞悬液和超声。
10. 用血细胞计数器对旋转培养瓶培养的 HeLa S3 细胞进行细胞计数。
11. 将 5 ×107 个细胞在离心机中室温 1800 g 离心 5 min,弃上清。
12. 将细胞悬浮于 25 ml 完全 MEM-10 培养基中,放入 150 cm2 组织培养瓶中,培养过夜(第二天进行感染)。
13. 吸出培养基,加入 0.25 ml 的细胞裂解液(步骤 9)和 1.75 ml 完全 MEM-2.5 培养基。培养 1 h,每隔 15~30 min 轻轻摇动一次。
14. 加入 25 ml 完全 MEM-2.5 培养基(此步骤不需要筛选),培养 3 天。
15. 使细胞与培养瓶分离(如果需要可以借助摇晃或细胞刮刀),用吸管将细胞悬液转移到离心管中,于 5~10℃,1800 g 离心 5 min,弃培养基。
16. 细胞用 2 ml MEM-2.5 培养基重悬。按照步骤 5 的方法反复冻融裂解细胞悬液。
17. 测定病毒储液的滴度,再将其存放于 -70℃。
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