标签: 病毒透射电镜 标本制备 病毒学检验第一篇第十三章
来源:《病毒学检验》
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悬液应尽量除去杂质如培养基残渣,细胞碎片、糖类及各种盐类的结晶等,这些杂质的存在会干扰染色及电镜观察。用该法的缺点是由于电子穿透能力很弱,只能观察病毒的外貌,无法见其内部结构,如果要观察其内部结构则必需进行超薄切片。
悬滴标本还必须注意悬液标本的浓度,浓度太稀,则在电镜下寻找极为困难。浓度太浓,会因标本的堆集而影响观察。因此在制样时,最好同时选择几种不同浓度进行滴样,挑选合适浓度的铜网进行观察。
负染色法主要有两种:
(1) 悬滴法:用一根细滴管或结核菌素注射器吸一滴标本悬液滴在有膜的铜网上,如带膜铜网已从滤纸上取下,则此铜网很可能被吸到加标本的吸管头上或注射器针头上,铜网上也可能被翻转而污染,故采用悬滴法时,应将带膜铜网粘附于滤纸上,切不可取下。铜网滴上标本后静置片刻,然后用滤纸从铜网边上吸去多余的标本悬液,未待标本干燥即滴上负染色液。染色 1~2 min, 用滤纸吸去多余染液,再用蒸馏水滴在铜网上洗 1~2次,再用滤纸吸去水分,待干后用电镜观察。
(2) 漂浮法:漂浮法是将有膜的铜网的膜面覆盖漂浮于标本悬液上。具体方法是先将滤纸在加温熔化的液体石蜡中浸渍后取出,干后即成带蜡滤纸。用吸管吸取标本悬液滴于蜡滤纸上,将带膜铜网覆盖其上, 1~2 min 后用镊子夹起铜网,用滤纸吸去多余的标本悬液,在另一蜡纸上滴一点负染色,将吸有标本的铜网膜面向下漂浮于负染色液滴上,染 1~2 min, 用镊子夹起铜网,用滤纸吸去多余的染液,待干后用电镜观察。
负染色技术已是当代电镜生物标本制备中一项应用普遍、效力较高而又比较简便的技术,尤其在病毒学研究中,对揭示病毒的形态结构十分有效,对病毒学的发展起了较大的作用。
负染色方法有如下突出的优点:明显提高了标本的反差和分辨力。简便易行,不要求高纯度的标本制备。染色本身不改变生物标本的活性,不因染色而造成标本变形。
将抗病毒血清分别稀释为 1: 200~1: 6 400, 然后将不同稀释度的抗病毒血清分别滴于蜡盘或蜡纸上,将有膜铜网覆盖漂浮于液面上(室温 18~20℃) 孵育 5 min, 然后再将铜网移至病毒悬液中漂浮室温反应 15min, 取出铜网吸干,用蒸馏水漂洗 1-2次,再用 1%-2%磷钨酸染 3-5 min, 用滤纸吸去负染液,干燥后电镜检查,其病毒的检测率要比一般悬滴法为高。
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