标签: 鞭毛染色 微生物学实验第三版
细菌的鞭毛很纤细,其直径通常为0.01~0.02μm,所以,除了很少数能形成鞭毛束(由多根鞭毛构成)的细圈可以用相差显微镜直接观察到鞭毛束的存在外,一般细菌的鞭毛均不能用光学显微镜直接观察到,而只能用电子显微镜观察。要用普通光学显微镜观察细菌的鞭毛,必须用鞭毛染色法。鞭毛染色方法很多,本实验介绍硝酸银染色法和改良的Leifson氏染色法,前一种方法更容易掌握,但染色剂配制后保存期较短。内容来源于《微生物学实验(第三版)》
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鞭毛染色的基本原理,是在染色前先用媒染剂处理含使它沉积在鞭毛上,使鞭毛直径加粗,然后再进行染色。
1. 菌种的准备 要求用活跃生长期菌种作鞭毛染色和运动性的观察。对于冰箱保存的菌种通常要连续移种 1~2 次,然后可选用下列方法接种培养作染色用菌种:
1.1 取新配制的营养琼脂斜面(表面较湿润。基部有冷凝水)接种, 28~32℃ 培养 10~14 h, 取斜面和冷凝水交接处培养物作染色观察材料;
1.2 取新制备的营养琼脂(含 0.8~1.0% 的琼脂)平板,用接种环将新鲜菌种点种于平板中央, 28~32℃ 培养 18~30 h, 让菌种扩散生长,取菌落边缘的菌苔(不要取菌落中央的菌苔)染色观察的菌种材料。
2. 载玻片的准备
将载玻片在含适量洗衣粉的水中煮沸约 20 min, 取出用清水充分洗净,沥干水后置 95% 乙醇中,用时取出在火焰上烧去酒精及可能残留的油迹。
3. 菌液的制备
取斜面或平板菌种培养物数环于盛有 1~2 ml 无菌水的试管中,制成轻度混浊的菌悬液用于制片,也可用培养物直接制片,但效果往往不如先制备菌液。
4. 制片
取一滴菌液于载玻片的一端。然后将玻片倾斜,使菌液缓缓流向另一端,用吸水纸吸去玻片下端多余菌液,室温(或 37℃ 温室)自然干燥。
干后应尽快染色,不宜放置时间过长。
5. 染色
涂片干燥后,滴加硝酸银染色 A 液覆盖 3~5 min, 用蒸馏水充分洗去 A 液,用 B 液冲去残水后,再加 B 液覆盖涂片染色约数秒至 1 min, 当涂面出现明显褐色时,立即用蒸馏水冲洗。若加 B 液后显色较慢,可用微火加热,直至显褐色时立即水洗。自然干燥。
配制合格的染色剂(尤其是 B 液)、充分洗去 A 液再加 B 液、掌握好 B 液的染色时间均是鞭毛染色成败的重要环节。
6. 镜检
干后用油镜观察。观察时,可从玻片的一端逐渐移至另一端,有时只在涂片的一定部位观察到鞭毛。
菌体呈深褐色。鞭毛显褐色、通常呈波浪形。
1. 良好的培养物,是鞭毛染色成功的基本条件,不宜用已形成芽孢或衰亡期培养物作鞭毛染色的菌种材料,因为老龄细菌鞭毛容易脱落。
2. 玻片要求光滑、洁净,尤其忌用带油迹的玻片(将水滴在玻片上。无油迹破片水能均匀散开)。
3. 挑菌时,尽可能不带培养基。
1. 载玻片的准备 菌种材料的准备同硝酸银染色法。
2. 制片
用记号笔在载玻片反面将玻片分成 3~4 个等分区。在每一小区的一端放一小滴菌液。将玻片倾斜,让菌液流到小区的另一端,用滤纸吸去多余的菌液。室温或 37 ℃ 温室自然干燥。
3. 染色
加 Leifson 氏染色液覆盖第一区的涂面,隔数分钟后,加染液于第二区涂面,如此继续染第三四区。间隔时间自行议定,其目的是为了滴定最佳染色时间。在染色过程中仔细观察,当整个玻片都出现铁锈色沉淀、染料表面现出金色膜时,即直接用水轻轻冲洗(不要先倾去染料再冲洗。否则背景不清),染色时间大约 10 min,自然干燥。
4. 镜检
干后用油镜观察。
菌体和鞭毛均呈红色。
1. 玻片要求光滑、洁净,尤其忌用带油迹的玻片(将水滴在玻片上。无油迹破片水能均匀散开)。
2. 挑菌时,尽可能不带培养基。
3. 不要先倾去染料再冲洗。否则背景不清。
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