标签: 环核苷酸依赖性蛋白激酶 蛋白激酶分析 精编分子生物学实验指南第五版第十七章
蛋白激酶的分析是使用标记的供体底物,当酶样品中含有磷酸转移酶活性时,蛋白质或多肽受体底物中标记物的积累就很容易被检出。内容来源于《精编分子生物学实验指南(第五版)》
0 收藏 0 阅读
1. 每个分析反应按以下比例将反应组分加入 1.5 ml 微量离心管中,保持冰浴:
5 × 环核苷酸依赖性蛋白激酶反应缓冲液
1 μl 10 mg/ml 组蛋白 2B
1 [γ-32P] ATP 溶液(ATP 终浓度为 5 μmol/L,放射活性为 5 μlCi/μl)
1 μl 20 × 环核苷酸
0~13 μl 水
盖好离心管,混匀,放入 30℃ 水浴。
每一反应做三份并设立无底物、酶、环核苷酸等各组分的实验对照。每个反应的体积为 20 μl。
2. 加入 1~14 μl 有环核苷酸依赖性蛋白激酶活性的预冷酶样品,开始反应。酶的加量取决于样品中酶活性的大小,在预试验中所得最大反应值可衡量磷酸转移反应的程度。
3. 30℃,温育 10 min。
4. 按不同的分析方法加入适当的试剂停止反应:加入 20 μl 10 % 预冷的 TCA 进行 TCA 沉淀,或 10~20 μl 预冷的 2 × SDS - PAGE 样品缓冲液进行电泳分析。
1. 在反应中为了保持磷酸基与底物的线性结合关系可适当减小酶的加量。
2. 对于吸附在 Sepharose 珠上的免疫沉淀的酶样品,先制备没有酶源的反应混合物,预热后加入免疫沉淀物。在免疫沉淀物分析时建议将容积扩大为 100 μl,可在 75 μl 反应缓冲液中加入 25 μl 吸附着免疫沉淀物的凝胶珠。
更有优质直播、研选好物、福利活动等你来!
本网站所有注明“来源:丁香园”的文字、图片和音视频资料,版权均属于丁香园所有,非经授权,任何媒体、网站或个人不得转载,授权转载时须注明“来源:丁香园”。本网所有转载文章系出于传递更多信息之目的,且明确注明来源和作者,不希望被转载的媒体或个人可与我们联系,我们将立即进行删除处理。
我的询价
询价列表
暂时没有已询价产品
手机验证
科研好物关注研选号