标签: 菌株 四分体孢子 精编分子生物学实验指南第五版第十三章
一种新的酵母菌株的构建方案分为几个不同的步骤:①二倍体的构建,在这里两个单倍体进行交配;②孢子形成,在这里二倍体细胞被诱导形成孢子;③四分体孢子的制备,在这里囊壁被从四分体孢子上除去;④四分体孢子的分离,在这里来自一个单独的四分体抱子的四个单倍体抱子中的每一个都被明确地安置在一块平板上,并继续生长用作以后的研究。来源:《精编分子生物学实验指南》第五版
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1)挑YPD或选择性平板上的酵母菌单菌落接种在孢子形成平板上。如果无需选择的话,细胞在转移到孢子形成平板之前,可以在YPD平板上先培养几天。单个菌落在YPD平板上生长3〜4天,而对成小块细胞来说,可在YPD平板上生长2天。这种预生长并 非必需的,但它可以使孢子形成的效率更高些。在转移酵母细胞时,应用少量细胞在孢子形成平 板上涂布相对较大的面积(约1cm2),不应见到成团的接种物。
2)于25℃培养4天。在较髙的温度下孢子形成的效率一般很低。在缺乏氨基酸或其他酵母菌有丝分裂生长所必需的营养成分时,酵母菌就会进行减数分裂形成孢子。某些特殊的酵母菌必须添加特定的营养成分孢子 形成才会更加完全。
3)在载玻片上滴一滴水,挑少量细胞稀释在水中,于放大倍数250×〜400×显微镜下观察悬浮于水中的四分体孢子。
4)四分体呈成簇的4个小球(孢子),被固定于一个致密的子囊中。四个孢子排列为钻石状或正四面体状。
如果二倍体基因型无特别的选择标志(当单倍体亲本中的一种具有与二倍体相同的营养需要时),使用解剖显微镜从交配混合物中“拉出合子”,可达到分离二倍体的目的。交配4 h以后,在适合二倍体生长的平板上将交配混合物画几条平行线,使用解剖显微镜通过其典型的形态确认合子细胞,用分离针将它们挑出、与其他细胞分开,为了保证选择的细胞确实是二倍体,将它们接种在孢子形成平板上,经过适当条件培养后,在显微镜下检查四分体孢子的形成。也可采用另一种方法确认:用一对交配型实验菌株与选择出的细胞进行交配,在显微镜下检査每个实验株的合子形成情况,如果二倍体挑选正确,那么就不可能形成合子。
1)在合适的培养容器中,加入YPD培养基培养,待形成孢子的二倍体细胞生长至 OD600为 2.5〜3.0 (约为 8×107 细胞/mL)。
2)转移1 mL培养液至一支无菌15 mL聚丙烯试管中,1200 g离心5 min。
3)倒去上清,用5 mL无菌水重悬细胞,涡旋振荡使细胞充分悬浮,再按步骤2离心。
4)倒去上清,细胞用1 mL添加了特定二倍体细胞所需营养成分的孢子形成液体培养基悬浮。
5)于30℃,350 r/min以上转速培养2〜3天,在显微镜下检査孢子的形成。
如果酵母菌株难以诱导形成孢子,用YPA培养基预培养细胞。用乙酸作碳源时,酵母菌需要呼吸,而呼吸作用是孢子形成所必需的。
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