实验试剂仪器的具体要求见「其他」。
1. 培养待标记的细胞至适当的生长期。 生长旺盛的细胞中磷酸盐转运达到最高峰,除非研究静止期细胞的蛋白质磷酸化,一般待标记的细胞生长密度不要达到汇片,标记前 3~18 h 换新鲜的培养液培养将有利于标记。
2. 吸去培养液,用 37℃ 的含血清不加标记物的标记培养液洗尽残存的含磷酸盐的培养液,吸尽该培养液。
3. 加入预热的标记培养液,加入量为:(0.5~1 ml)/35 mm 培养皿,(1~2 ml)/50 mm 培养皿,或(2~4 ml)/100 mm 培养皿。
4. 在树脂玻璃挡板后操作,使用配备塞有棉花防浮质吸管的微量移液器加入 32P 至终浓度为 0.1~2 mCi/ml。 标记 1~2 h 已足够,但细胞可在 6 h 内耐受高达 2 mCi/ml 和在 18 h 内耐受低浓度(0.1~0.5 mCi/ml)的辐射。
5. 将培养皿置于预热的树脂玻璃盒中,并将盒子置于培养箱中。
6. 标记结束时,将装有标记细胞的树脂玻璃盒移至冷室,放在树脂玻璃挡板后面。
7. 从树脂玻璃盒子中取出培养皿,用一次性的移液管吸尽标记培养液,培养液和吸头或吸管均作为同位素废物弃置。
8. 用 2~10 ml 冷 TBS 洗涤细胞 2 次,同步骤 7 一样吸尽并弃去放射性废物。
9. 加适量裂解缓冲液(0.3 ml/35 mm 培养皿,0.6 ml/50 mm 培养皿或 1.0 ml/ 100 mm 培养皿),用橡皮细胞刮子擦刮下贴壁细胞,裂解物留在培养皿上,4℃ 放置 20 min。用橡皮细胞刮子将贴壁细胞的裂解液移至培养皿边缘,并将裂解液移入带螺口盖的微量离心管中。
10. 盖上管盖,于 4℃ 26000 g 离心 30 min 澄清裂解液。
11. 离心后,将上清(裂解物)移至新离心管中,离心管和沉淀作为同位素污物处理。
12. 用凝胶电泳、免疫沉淀或蛋白质纯化方法,分析标记的裂解液,所有过程均在4℃ 适当屏蔽下进行。
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