1. 实验前准备 1.1 材料 S-190 抽提物 核心组蛋白 1.2 试剂 缓冲液 R ATP 混合物 0.1mol/L MgCl2 DNA模板(2.5~25 kb 环状或线性化质粒,或 λDNA) 0.1mol/L CaCl2 200 U/ml 微球菌核酸酶储液 0~5 mol/L EDTA 10 mg/ml Rnase A 糖原终止缓冲液 2.5 mg/ml 蛋白酶 K 50:49:1(V/V/V)酚/氯仿/异戊醇,用 10 mmol/L Tris· Cl, pH 8.0 平衡 2.5 mol/L 乙酸铵 70% 和 100% 乙醇 1.2%(m/V)琼脂糖凝胶 TBE 缓冲液 123 bp DNA 梯度(Life Technologies) 1.3 仪器耗材 27℃ 和 37℃ 水浴步骤
2. 混合 40 ul 缓冲液R、190 抽提物及核心组蛋白。室温孵育 30 min。
3. 加入 10 ul ATP 混合物,0.1 mol/L MgCl2 至终浓度为 7 mmol/L, 500 ng DNA 模板。27℃ 水浴 5 h。如有需要,用缓冲液 R 补齐至100 ul。
4. 加入 3 ul 0.11 mol/L CaCl2 至组装反应体系中。将反应液等分为两份(a 和 b)。用缓冲液R按 1:50 和 1:150 稀释微球菌核酸酶(200 U/ml)。
5. 隔一定的时间间隔(如 15 s ),在 a 管中加入 5 ul 1:150稀释液,在 b 管中加入 1 : 50 稀释液。室温消化 10 min。
6. 加入 7 ul 0.5 mol/L EDTA 终止反应的进行。加入 1 ul 10 mg/ml 的 RNase A 溶液, 室温孵育 10 min。
7. 每个反应中加入 95 ul 糖原终止缓冲液,5 ul 2.5 mg/ml 的蛋白酶 K 溶液。37℃ 温育 30 min。
8. 使用 200 ul 50:49:1 酚/氯仿/异戊醇抽提。取出 150 上层水相加入15 ul 2.5 mol/ L 乙酸铵、450 ul 100% 乙醇沉淀 DNA。室温以最大转速离心 15 min,用 200 ul 70% 乙醇洗涤沉淀。室温以最大转速离心 5 min,在空气中干燥 5 min。
9. 用 6 ul 凝胶上样缓冲液重悬沉淀,在 1×TBE,电压约 5~10 V/cm 进行 1.2% 琼脂糖凝胶电泳。使用 123 bp DNA梯度作为分子质量指标。用溴化乙锭染色。
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