反转录病毒载体如图12. 5.1所示,用 C M V I E 启动子代替V L T R 的 U 3 区。2 . 用 Beckman polyallomer (聚丙烯和聚乙婦的聚合物)高速密封离心管和vTi 50转子 的超速离心机,氯化铯法提纯包含目的基因的病毒载体后,再用碱裂解法纯化。 3. 转染之前的24h ,接种IXlO6 293GP细胞于IOml完全DMEM/10% FBS的 IOOmm 细胞培养皿中。孵育。 4. 转染当天,在灭菌的6m l的聚丙烯管里混合20哗氯化铯纯化的病毒载体D N A和 2(V g p C M V -G ,它包含C M V I E 启动子控制的V S V -G 基因。用 T E 79/10调整体积 到437卩1。 5. 加 63W 2 3mol/L CaCl2并混匀,然后加5(%1 2X He B S 并持续搅" src="http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2016/08/A1470279908473xymh9pksyepng_small.jpg" style="width: 388px; height: 314px;" /> 假包膜反转录病毒载体的小量( 〈 i 00mi) 收集 9a. 在 W C 薩 冻 存 的 病 毒 ,冑 移 到 如 ^ 的 麵 誠 层 流 通 风 橱 紫 外 线 灭 菌 过 細 Beckman超净离心管里。以 50 〇〇〇g ,代 离 心 9〇min。 l〇 a•在层流通风橱弃去细胞上清液。用 〇.5% 〜 1 % 最初体积的DMEM/1〇 % F B S 或 0. I X H B S S 重悬病毒颗粒, 4°C 。温和的用吸移管分散病毒聚集物。孵育过夜。 lla. 分装病毒L 一 70°C保 存 (通常有传染性的病毒<5〇%复 苏 的 ) 。 为 进 一 步 提 高病毒 滴度,进行第二个超速离心步骤( 已经被证实滴度可高达109c:fu/ml)。 对于假包艇反转录病毒载体的大量收集 9b. 在 37° C 融 解 冻 存 的 病 毒 ,转 移 到 灭 菌 的 250m i 宽 嘴 离 心 瓶 。 4〇c , 13 〇〇〇g_ (9000r/min用 G S A 转子)离 心 15h 以沉淀病毒。 10b. 4°C 重悬病毒颗粒。温和的用吸移管分散病毒聚集物。孵 育 4h。 llb. 分装病毒,一7〇°C 保 存 ( 通常有传染性的病毒是复苏的2 0 % 〜4 0 % ) 。 1 2 . 转染前 2 4 h , 每 I O O m m 细胞培养皿2 X I O 5 的密度接种鼠N I H 3 T 3 细胞在D M E M / 10% F B S 中。 13. 0 •1、 1 和 IOjbJ 收获的病毒传染细胞在含“ g/m l 聚凝胺培养基中。孵育过夜。 14. 换新鲜的D M E M /10% F B S 培养基并加80(V g / m l 的 G 418。 每 3d 重复1 次。 15.感染后两个星期, 1〇〇%甲醇固定G 418抗性克隆lOmin, 0 . 0 4 % 吉姆萨染色液染色 lOmin,计数。用 G 418抗性克隆的数目乘以对应稀释倍数确定未稀释病毒原种的 滴度,表示成cfu/m l。 备 选 方 案 来 自 稳 定 包 装 细 胞 的 假 包 膜 反 转 录 病 毒 的 制 备 这个方案对假包膜反转录病毒载体的大量制备是有用的。 附加材料( 基本方案;标V 的条目参见附录1) 双向性包装细胞株PA317的培养物 包含目的基因和neo 基因的反转录病毒载体 V 80m g/m l潮霉素" src="http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2016/08/B14702799411488dwbvi385mpng_small.jpg" style="width: 408px; height: 577px;" />