建议在短日照条件下培养材料以诱导营养生长,并在照光的早期收取材料以提高获得完整叶绿体的产率。所以试剂应在收集材料之前准备好,并连同其他一些设备,如离心机转头及离心管等在冰箱或冰上冷却至 0~4°C。为避免叶绿体过多地暴露于光下或破碎,所有操作应尽可能在绿光下迅速完成。整个分离过程 30~40 min 可以完成。
( 1 ) 在 10 h 光照(23°C ) / 14 h 黑暗(17°C ) 光周期条件下培养拟南芥材料 5~6 周,开花前收取叶片。
( 2 ) 配制所有溶液,并连同所有设备(包括离心机以及转头)一起冷却至 0~4°C。
( 3 ) 剪取植物叶片(见注释 2) ,并用蒸馏水清洗以确保没有土壤附着。
( 4 ) 按每 10 g 材料加 100 ml 匀浆缓冲液(介质 A ) 的比例将材料和预冷的缓冲液混和在带有利刃的搅拌机中研磨 3 次,每次 10s。
( 5 ) 匀浆液用双层尼龙布过滤(22 μm,见注释 3) 。
( 6 ) 滤液在 1300 g 离心力下离心 3 min,沉淀即为叶绿体粗提物。
( 7 ) 将叶绿体粗提物重新悬浮在尽可能小体积的介质 B 中(轻轻搅动液体让沉淀悬浮)。将悬浮的粗提物置于 Percoll 非连续梯度(40%~85%,见注释 4 ) 表面,用 swing-out (非固定转角)转头在 3750 g 离心力下离心 10 min。