热稳定 DNA 聚合酶 为了避免碱基的错误掺入,在重叠延伸诱变反应中应使用带 3'—5'外切核酸酶校对能力的髙效热稳定 DNA 聚合酶。另外. 使用的 DNA 聚合酶一定不能具有催化非模板性掺入腺苷酸残基的能力。具备此种特性的 DNA 聚合酶包括 Puo DNA 聚合酶 (Boehringer Mannheim),rTth DNA 聚合酶 XL(Pwkin Elmer)。VentR DNA 聚合酶(New England Biolabs) 和 Pfu DNA 聚合酶 (Stmagene)。 为长片段 PCR 反应所设计的热稳定 DNA 聚合酶混合物也适用于重叠延伸诱变反应。
凝胶
含 0.5ug/ml 溴化乙锭的琼脂糖凝胶(1%) 或聚丙烯酰胺凝胶 请见步骤 6 和 11。
核酸和核苷酸
寡核苷酸引物 每种引物的长度应为 20~30 个核苷酸. 含有大致相同数量的四种碱基,G 和 C 残基的分布应均匀,较低的形成稳定二级结构倾向。诱变引物 FM 和 RM 之间至少有 15 个碱基的重叠序列(请见图 13-4), 错配碱基应位于引物序列的中部。在扩增 DNA 片段的 3'和 5'端引物(即具有野生型序列 R2 和 F2 引物)可以设置单一的限制性酶切位点,以便于后续步骤中诱变 DNA 片段的克隆。引物设计的一般原则,请见第 10 章中导言部分关于核苷酸引物的设计。 在 DNA 自动合成仪上合成的寡核苷酸引物一般不需要纯化,可直接用在重叠诱变中。
模板 DNA 诱变中使用的模板通常是含感兴趣的基因或 cDNA 的质粒 DNA。将 DNA 以 1ug/ml 的浓度溶解在含低浓度 EDTA(<0.1 mmol/L) 的 10mmol/L Tris-Cl(pH7.6) 的溶液中。