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质粒DNA提取及琼脂糖凝胶电泳检测

标签: 质粒DNA 提取 电泳

质粒(Plasmid)是细菌染色体外能自身独立复制的双股环状DNA。带有遗传信息,可赋予细菌某些新的表型。分离和纯化质粒DNA的方法很多,但这些方法基本包括三个步骤:即(1)细菌的培养和质粒DNA的扩增;(2)细菌菌体的裂解;(3)质粒DNA的提取与纯化。

详细
实验方法
  • 质粒DNA提取及琼脂糖凝胶电泳检测
实验方法原理

1、碱变性法提取质粒DNA:细菌培养物加入SDS和NaOH碱性溶液处理后,菌体裂解,可使细菌的质粒DNA、染色体DNA和RNA一起从细胞内释放出来,经琼脂糖凝胶电泳,因各种核酸分子的迁移率不同将上述核酸分成不同的带。用溴化乙锭(EB)染色后,在紫外线灯下可看到各种核酸带发出的荧光。根据荧光的位置,可区分不同的核酸带。


2、琼脂糖凝胶电泳:琼脂糖凝胶电泳技术(Agarosegelelectroghoresis)是分离、鉴定和提纯DNA片断的有效方法。凝胶分辨率决定于使用材料的浓度,并由此决定凝胶的孔径。琼脂糖凝胶可分辩0.1——6.0kb的双链DNA片段。琼脂糖凝胶电泳是一个电场作用。它首先利用琼脂糖的分子筛效应,此外,在弱碱性条件下,DNA分子带负电荷,从负极向正极移动。根据DNA分子大小、结构及所带电荷的不同,它们以不同的速率通过介质运动而相互分离。借助溴化乙锭(EB)能与双链DNA结合的作用,利用EB染色,并通过紫外线激发即可观察被分离DNA片段的位置。

实验材料
试剂、试剂盒
仪器、耗材
实验步骤
一、碱变性法提取质粒DNA


1.接种细菌于5mlLB液体培养基中,37℃培养过夜。


2.3000rpm/min,离心15min,弃上清。加入100ul溶液Ⅰ悬起细菌沉淀。


3.加入200ul前新配制的溶液II,颠倒EP管5次混合均匀,置冰浴2min。


4.加入150ul溶液III温和地混匀,12000rpm/min,离心5min。


5.吸取上清清亮裂解液放入另一新EP管中,加等体积酚-氯仿-异戊醇抽提2次,12000rpm/min,离心2min。(若不做酶切,此步可省略)吸取上清放入另一新EP管中,加入二倍体积的冷乙醇,12000rpm/min,离心10min。


6.弃乙醇,干燥后用30ulTE缓冲液洗下核酸,待电泳检测。


二、琼脂糖凝胶电泳


1.取琼脂糖0.9g,加入100ml1xTAE电泳缓冲液于250ml烧瓶中,100℃加热溶解。


2.平衡凝胶槽,放好两侧挡板,调节好梳子与底板的距离(一般高出底板0.5——1mm)。


3.铺板:在溶解好的凝胶中加入终浓度为0.5ug/ml的溴化乙锭水溶液,轻轻混匀,待冷至50℃左右倒入凝胶槽,胶厚一般为5——8mm。


4.待胶彻底凝固后,去掉两侧挡板,将凝胶放入盛有电泳液的槽中(加样孔朝向负极端,DNA由负极向正极移动),使液面高出凝胶2——3mm,小心拔出梳子。


5.DNA样品与载体缓冲液5:1混合并加入凹孔中(样品不可溢出)。


6.打开电源,调节所需电压,电压与凝胶的长度有关,一般使用电压不超过5v/cm。


7.据指示染料移动的位置,确定电泳是否终止(溴酚蓝的涌动距离在5sRNA和0.3kbDNA带之间)。


8.电泳完毕关闭电源。将凝胶放紫外灯下观察并拍照。

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注意事项
1. 在紫外灯下观察室应该带上防护眼镜,以免强紫外光伤害眼睛。


2. 如果DNA条带不够窄且不够均匀,可能是以下几个方面造成的:①DNA过载,②电压过高,③加样孔破损,④凝胶中有气泡。

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其他

1. 凝胶电泳不仅可以分离不同相对分子质量的DNA,也可以分离相对分子质量的相同但是构型不同的DNA分子,药物不同构型的分子在凝胶电泳上面的迁移率也是不同的。


2. DNA的分子越小,迁移速度越快;琼脂糖的浓度越低,迁移速度越快,DNA环状的或带切口环状的通常都比线装的DNA迁移速度快。

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  • johnlinwen

    johnlinwen

    2个月前 觉得难

    非常有用 感谢

  • 沐雨清兰

    沐雨清兰

    3个月前 觉得一般

    溴化乙锭是一种致癌物或致畸剂。试验过程中要小心使用,戴手套戴口罩。

  • HR微生物

    HR微生物

    3个月前 觉得简单

    EB浓一点,注意胶孔有没有破裂,上样留一半。

  • viviank

    viviank

    3个月前 觉得很简单

    很简单,但有很多细节:质粒提取要适当浓缩,一般培养过夜的质粒3管浓缩成一管,挺好的

  • 丁香通

    丁香通

    3个月前 觉得简单

    质粒提取说简单也简单,说不简单也不简单,重复的次数多了,就会提的好,跑胶也是很有讲究的,要能分开条带,电压合理很重要,Marker也很重要。

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