(5)NAD(氧化辅酶Ⅰ)3.3mg/ ml (3.3mgNAD溶于0.5 ml 水,用NaOH调至pH7.0,再定容为1 ml )。
(6)CoA(辅酶A)(每支50单位,250单位相当于1mg)。
(7)TPP(焦磷酸硫胺素)50mg/ ml (3.3mgNAD溶于0.5 ml 水,用NaOH调至pH7.0,再定容为1 ml )。
(8)0.2MMgCl2(2.03gMgCl2·6H2O定容于为50 ml )。
(9)1.1M葡萄糖(10.9葡萄糖加水定容为50 ml )。
(10)0.1M琥珀酸(0.118g琥珀酸溶于5 ml 水,用NaOH调至pH7.0,再定容为10 ml )。
3.0.1M丙二酸(pH7.0)
0.017g丙二酸溶于1 ml 水中,用NaOH调至pH7.0,再定容为2 ml 。
4.0.025 N HCl
二、实验步骤
1.线粒体悬浮液的制备
(1)25℃下暗处萌发3-4天的绿豆芽,摘取子叶,去掉下胚轴、根和芽。
(2)取30g子叶、40 ml 提取液和少量石英砂,在研钵中(研钵置于冰盐浴中)快速研磨成匀浆,双层纱布过滤。
(3)滤液于0℃下,3000rpm离心10分钟,弃去沉淀。
(4)上清液于0℃下,12000rpm离心20分钟,弃去上清液。沉淀悬浮于18 ml 提取液中。
(5)上述悬浮液在0℃,12000rpm下离心20分钟,弃去上清液,沉淀悬浮于2 ml 提取液中,即为线粒体悬浮液。保存在冰箱中。
2.仪器安装及耗O2量的测定
反应瓶主室中按下表加入反应液:
如图,安装好测氧仪、氧电极、记录仪。检查仪器是否正常。在侧臂中加入0.5 ml 线粒体悬浮液,插入氧电极,密闭反应瓶,待测氧仪稳定后,将侧臂内线粒体悬浮液轻轻倒入反应室,在磁力搅拌器上搅拌或不断地轻轻摇动反应瓶。20℃下反应10分钟。记录氧分压的变化,由记录曲线比较正常的线粒体和加抑制剂的线粒体耗O2的变化。