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| 实验方法原理 |
按照预定位置固定在固相载体上很小面积内的千万个核酸分子所组成的微点阵阵列。在一定条件下，载体上的核酸分子可以与来自样品的序列互补的核酸片段杂交。如果把样品中的核酸片段进行标记，在专用的芯片阅读仪上就可以检测到杂交信号。 基因芯片基本技术流程图 |
|---|---|
| 实验材料 | |
| 试剂、试剂盒 | |
| 仪器、耗材 | |
| 实验步骤 |
一、总RNA提取 1. 将超低温保存的样品除去样品袋，在电子天平上称重后，转移至用液氮预冷的碾钵中，用杵子碾磨组织，其间不断加入液氮，直至碾磨成粉末状。 2. 将碾磨成粉末状的样品，转移至已经加入适量TRIzol试剂的匀浆管中，把匀浆管置于冰浴中，在组织匀浆粉碎机上进行匀浆。匀浆至匀浆液不粘且无颗粒即可。 3. 将匀浆液转移至15 mL离心管中， 于4℃，12 000 g，离心10 min。 4. 小心吸取上清液转入新的15 mL离心管，在15~30℃放置5 min。 5. 向匀浆液中加入氯仿，盖紧离心管盖，用力震荡离心管，在15~30℃放置3 min。 6. 于4℃，12 000 g，离心15 min。 7. 从离心机中小心地取出离心管，吸取上清至另一15 mL离心管。 8. 向上清加入异丙醇，轻轻颠倒离心管充分混匀液体，在15~30℃放置10 min。 9. 于4℃，12 000 g，离心10 min。 10. 弃去上清，缓慢地沿管壁加入75%乙醇5 mL，轻轻颠倒洗涤离心管管壁，小心弃去乙醇。 11. 再加入75%乙醇10 mL，在涡旋器上短暂涡旋；于4℃，8 000 g离心10 min。 12. 小心弃上清，短暂离心，用移液枪吸去所有上清，在超净工作台中干燥沉淀5 min。 13. 加入RNase-free的Milli-Q水完全溶解RNA沉淀后，-80℃保存。 二、探针标记与杂交 1. 预杂交 （1） 配制预杂交液：杂交试剂1加入到的Eppenderf管中，振荡混匀后，加入杂交试剂2混匀。 （2） 将配制好的预杂交液放入95℃水浴锅内变性2 min，将待预杂交的玻片放入95℃水浴锅内变性30 s，玻片取出后即放入无水乙醇中30 s，晾干。 （3）将已变性的预杂交液加到玻片的点样区域内，盖上盖玻片，放入杂交箱内42℃预杂交5～6 h。 2. 标记探针（以下在冰浴中进行） （1）于一已灭菌的1.5 mL Eppendorf管内依次加入以下试剂(反应终体积为50 uL，以下试剂均为RNase－free)： ddH2O 23 uL 逆转录引物 5 uL 总RNA 50~100ug 振荡混匀，置于70℃水浴10 min。取出后，迅速置于冰上。 （2） 分别加入以下试剂： 逆转录酶缓冲液 10uL DTT 5uL dNTPs 4uL （3） 而后在暗室中加入以下试剂： 逆转录酶 2 uL Cy5-dCTP或Cy3-dCTP 3 uL （4） 用手指弹打管壁以混匀样品，手浴2 min。将Eppendorf管置于42℃水浴2 h。 （5）依次在Eppendorf管中加入标记试剂I 4uL，65℃水浴10 min后加入标记试剂II 4 uL。混匀，合并对照组、实验组。避光，真空抽干至50 uL左右。 （6）使用DNA纯化柱（或乙醇沉淀）纯化DNA。 （7）将柱体在旋涡混合器上剧烈振荡摇匀，悬浮内溶的树脂。将柱顶端的小帽旋松四分之一圈，掰断柱下端的密封头。 （8）将柱置于一个1.5 mL的Eppendorf管中，以3 000 rpm离心 1min将柱置于另一个新的1.5 mL Eppendorf管中，去掉顶端的帽，将样品慢慢加到树脂上表面的中间，注意不要搅动柱体。以3 000 rpm离心2 min，经纯化的样品流出，被收集在支持用的Eppendorf管中。 （9）加入标记试剂III 8 uL，真空抽干。 3、杂交 （1）在抽干的探针管中加6.5 uL杂交试剂I，充分混匀，使探针溶解。再加入6.5 uL杂交试剂II，混匀备用。 （2）将预杂交的玻片取出，用ddH2O冲去盖玻片。 （3）将探针置于95℃水浴中变性2 min；玻片置于95℃水浴中变性30 s，玻片取出浸无水乙醇30 s，探针取出后迅速置于冰上。 （4）将探针置于芯片上，用盖玻片覆盖，置于杂交舱中，用Parafilm密封，放入42℃杂交箱内杂交过夜(16～18 h)。 4、洗片 （1） 用0.5%的洗涤液1冲洗玻片，去除盖玻片。 （2） 准备两个染色缸，分别装有0.5%的洗片试剂1+2%的洗片试剂2、5%的洗片试剂3，放入60℃水浴锅中。 （3） 将玻片依次浸入以上两个染色缸中洗涤10 min。 （4） 用0.5%的洗涤液1冲洗玻片，晾干后扫描。 |
| 其他 |
一、基因芯片技术步骤 基因芯片技术主要包括四个主要步骤：芯片制备、样品制备、杂交反应和信号检测和结果分析。 1. 芯片制备 目前制备芯片主要以玻璃片或硅片为载体，采用原位合成和微矩阵的方法将寡核苷酸片段或cDNA作为探针按顺序排列在载体上。芯片的制备除了用到微加工工艺外，还需要使用机器人技术。以便能快速、准确地将探针放置到芯片上的指定位置。 2. 样品制备 生物样品往往是复杂的生物分子混合体，除少数特殊样品外，一般不能直接与芯片反应，有时样品的量很小。所以，必须将样品进行提取、扩增，获取其中的蛋白质或DNA、RNA，然后用荧光标记，以提高检测的灵敏度和使用者的安全性。 3. 杂交反应 杂交反应是荧光标记的样品与芯片上的探针进行的反应产生一系列信息的过程。选择合适的反应条件能使生物分子间反应处于最佳状况中，减少生物分子之间的错配率。 4. 信号检测和结果分析 杂交反应后的芯片上各个反应点的荧光位置、荧光强弱经过芯片扫描仪和相关软件可以分析图像，将荧光转换成数据，即可以获得有关生物信息。 二、基因芯片种类及特点 目前，基因芯片主要由寡核苷酸芯片和cDNA芯片两大类组成。以下分别介绍这两类芯片的基本原理和特点： 1. 寡核苷酸芯片(Oligonucleotides Chip) 概念：是指做在固相载体上的寡核苷酸微阵列。其制备方法以直接在基片上进行原位合成为主、有时也可以预先合成，再按照制备cDNA芯片的方法固定在基片上。原位合成(In situ synthesis)是目前制造高密度寡核苷酸芯片最为成功的方法，有几种不同的工艺，其中最著名的是美国Affymetrix公司(http://www.affymetrix.com)的专利技术——光引导化学合成法(Light-directed chemical synthesis process)。产品名为GeneChip。 Affymetrix公司已公开的光引导化学合成主要过程如下：首先根据杂交目的确定寡核昔酸探针的长度和序列。再由计算机设计出合成寡核苷酸时用到的所有光掩膜(Masks)。最后做探针合成。光导原位合成技术的优点是可以用很少的步骤合成极其大量的探针阵列，探针阵列密度可高达到每平方厘米一百万个。而这种方法的主要缺点：一是需要预先设计、制造一系列掩模，造价较高：二是每步产宰较低．因此合成探针的长度受到了限制。 此外，原值合成的方法还有Incyte Phamaceuticals5公司(http//www.incyte.com)和Rosetta Biosystem Inc公司等使用的基于喷墨打印原理的原价合成法(IN situ synthesis with reagents delivered by ink-jet printer devices)。喷印装置与普通的彩色喷墨打印机类似，用四种碱基液体取代墨盒中的彩色墨汁，通过计算机控制喷印机将特定种类的试剂喷洒到预定的区域上。冲洗、去保护、偶联等过程与传统的DNA固相原值合成技术相同。喷印法可以合成长度为40~50 nt的寡核昔酸链，每步产率可以达到99％，合成30nt的寡核昔酸产率可达70％以上。日本佳能公司利用其独创的气泡喷墨技术，仅用24 pl溶液就可以在基片上制作出近百微米的小探针点。每平方厘米可排布近20000个探针，克服了喷墨打印技术制备探针阵列密度较小的缺点。 寡核昔酸芯片的杂交和检测分析：样品处理和杂交检测方法与cDNA芯片是一致的。由于寡核昔酸阵列多需要区分单碱基突变。因此严格控制杂交液盐离子浓度、杂交温度和冲洗时间是杂交实验成败的关键。 2. cDNA芯片（cDNA Chip） 概念：在玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜等固相载体上固定的成千上万个cDNA分子组成cD4A微阵列。制作cDNA芯片最常用的固相载体是显微镜载玻片，载玻片在使用前需要进行表面处理，目的是抑制玻璃片表面对核酸分子的非特异性吸附作用。常用的表面处理方法有氨基化法、醛基化法和多聚赖氨酸包被法。 cDNA芯片的制备：制备cDNA芯片多用合成后点样法(Spotting after synthesis)，简称点样法。合成后点样法使用的专用设备称为点样仪(Arrayer)，目前有多家国外公司(如Bopdiscovery,Biorobotics,Vartesian Technologies,Genetic Microsystems,Genomicssolutions等)生产点样仪。点样仪的主要部件是由计算机系统控制的电脑机械手。点样时电脑机械手利用点样针头(Pin)从96或384檄孔板上蘸取cDNA样品，按照设计好的位置点在载玻片表面。针头的数目、机械手的移动时间、针头清洗和干燥时间、样品总数和载破片数目共同决定了点样所需时间；针头的直径和形状、样品溶液的粘滞程度以及固相载体的表面特性决定了芯片上液滴的量和扩散面积。 除点样法以外，cDNA芯片也可以用电子定位法(Electronic addressing)制备。美国Nanogen公司(http://www.nanogen.com)最早使用这项技术，他们对空白片上的持定位点进行电活化，使相应活化点的表面带有电荷，成为微电极，能够吸附cDNA分子。带有微电极的片子与样品溶液共同孵育，溶液中的cDNA分子被吸附的微电极上，并与片子表面发生化学结合从而固定。用这种工艺制备的芯片的优点是：微电极的电吸附作用可以提高与靶核酸的杂交效率。缺点是制备复杂．成本较高。这种带有微电极的芯片也称为主动式芯片。许多公司出售商品化的cDNA芯片，可以根据需要从公司定制。美国Incyte公司是显著名的cDNA芯片提供商之一，其产名为GEMTM芯片，每张片子上最多可以含有10000点，对样品中mRNA的检出限达到2pg，对两种来源样品中的基因差异表达的检出限为2倍。 3. cDNA芯片的使用方法--样品制备和杂交 样品制备包括分离和标记两个方面，有些样品还婴经过核酸扩增放大这一步骤。样品制备的一般过程是：提取待检样品中的mRNA，反转录成cDNA，同时标记上荧光(荧光标记为最常用的方法。优点是无放射性且有多种颜色可供使用；研究者可以根据需要选用其它标记方法，例如同位素标记法、化学发光法或酶标法；如果目的是研究两种来源的组织细胞基因的差异表达，则分别提取两种组织细胞的mRNA，反转录成cDNA，分别标记两种不同颜色的荧光(如Cy3和Cy5)，等量混合后与芯片进行杂交反应。 杂交反应可以在专用的杂交仪(Hybridization station)或杂交盒(Hybridization chamber)内进行。杂交仪能够容纳多张芯片，有利于杂交过程的自动化和杂交条件的标准化。单个反应可以在杂交盒里进行，斯坦福大学Patrick O.Brown教授领导的实验室将制作杂交盒的详细说明提供在互联网，同时还提供了cDNA芯片设备、样品处理与杂交的完整的实验手册和有关软件的下载，网址是：http://cmgm.stanford.edu/pbrowri/index.html。 4. 杂交信号检测和分析 通常检测芯片上的杂交信号需要高灵敏度的检测系统--阅读仪(Reader)，阅读仪的成像原理分为激光共焦扫描和CCD成像两种。前者分辨率和灵敏度较高，但是扫描速度较慢且价格昂贵。后者的持点与之相反。十祈一次标准的cDNA芯片杂交实验产生的成干上万个点的杂交信息，需要生物信息学手段的支持。已经有多种读取和分析杂交信号的应用软件以及能够与网络公共数据库连接进行数据分析的应用软件、在NHGRI的问站可以下载用于图像分析的软件，还可以找到能够与Genbank、Unigene等数据库联机工作的软件包。 |
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