1. 将超低温保存的样品除去样品袋,在电子天平上称重后,转移至用液氮预冷的碾钵中,用杵子碾磨组织,其间不断加入液氮,直至碾磨成粉末状。 2. 将碾磨成粉末状的样品,转移至已经加入适量TRIzol试剂的匀浆管中,把匀浆管置于冰浴中,在组织匀浆粉碎机上进行匀浆。匀浆至匀浆液不粘且无颗粒即可。 3. 将匀浆液转移至15 mL离心管中, 于4℃,12 000 g,离心10 min。 4. 小心吸取上清液转入新的15 mL离心管,在15~30℃放置5 min。 5. 向匀浆液中加入氯仿,盖紧离心管盖,用力震荡离心管,在15~30℃放置3 min。 6. 于4℃,12 000 g,离心15 min。 7. 从离心机中小心地取出离心管,吸取上清至另一15 mL离心管。 8. 向上清加入异丙醇,轻轻颠倒离心管充分混匀液体,在15~30℃放置10 min。 9. 于4℃,12 000 g,离心10 min。 10. 弃去上清,缓慢地沿管壁加入75%乙醇5 mL,轻轻颠倒洗涤离心管管壁,小心弃去乙醇。 11. 再加入75%乙醇10 mL,在涡旋器上短暂涡旋;于4℃,8 000 g离心10 min。 12. 小心弃上清,短暂离心,用移液枪吸去所有上清,在超净工作台中干燥沉淀5 min。 13. 加入RNase-free的Milli-Q水完全溶解RNA沉淀后,-80℃保存。 二、探针标记与杂交 1. 预杂交 (1) 配制预杂交液:杂交试剂1加入到的Eppenderf管中,振荡混匀后,加入杂交试剂2混匀。 (2) 将配制好的预杂交液放入95℃水浴锅内变性2 min,将待预杂交的玻片放入95℃水浴锅内变性30 s,玻片取出后即放入无水乙醇中30 s,晾干。 (3)将已变性的预杂交液加到玻片的点样区域内,盖上盖玻片,放入杂交箱内42℃预杂交5~6 h。 2. 标记探针(以下在冰浴中进行) (1)于一已灭菌的1.5 mL Eppendorf管内依次加入以下试剂(反应终体积为50 uL,以下试剂均为RNase-free): ddH2O 23 uL 逆转录引物 5 uL 总RNA 50~100ug 振荡混匀,置于70℃水浴10 min。取出后,迅速置于冰上。 (2) 分别加入以下试剂: 逆转录酶缓冲液 10uL DTT 5uL dNTPs 4uL (3) 而后在暗室中加入以下试剂: 逆转录酶 2 uL Cy5-dCTP或Cy3-dCTP 3 uL (4) 用手指弹打管壁以混匀样品,手浴2 min。将Eppendorf管置于42℃水浴2 h。 (5)依次在Eppendorf管中加入标记试剂I 4uL,65℃水浴10 min后加入标记试剂II 4 uL。混匀,合并对照组、实验组。避光,真空抽干至50 uL左右。 (6)使用DNA纯化柱(或乙醇沉淀)纯化DNA。 (7)将柱体在旋涡混合器上剧烈振荡摇匀,悬浮内溶的树脂。将柱顶端的小帽旋松四分之一圈,掰断柱下端的密封头。 (8)将柱置于一个1.5 mL的Eppendorf管中,以3 000 rpm离心 1min将柱置于另一个新的1.5 mL Eppendorf管中,去掉顶端的帽,将样品慢慢加到树脂上表面的中间,注意不要搅动柱体。以3 000 rpm离心2 min,经纯化的样品流出,被收集在支持用的Eppendorf管中。 (9)加入标记试剂III 8 uL,真空抽干。 3、杂交 (1)在抽干的探针管中加6.5 uL杂交试剂I,充分混匀,使探针溶解。再加入6.5 uL杂交试剂II,混匀备用。 (2)将预杂交的玻片取出,用ddH2O冲去盖玻片。 (3)将探针置于95℃水浴中变性2 min;玻片置于95℃水浴中变性30 s,玻片取出浸无水乙醇30 s,探针取出后迅速置于冰上。 (4)将探针置于芯片上,用盖玻片覆盖,置于杂交舱中,用Parafilm密封,放入42℃杂交箱内杂交过夜(16~18 h)。 4、洗片 (1) 用0.5%的洗涤液1冲洗玻片,去除盖玻片。 (2) 准备两个染色缸,分别装有0.5%的洗片试剂1+2%的洗片试剂2、5%的洗片试剂3,放入60℃水浴锅中。 (3) 将玻片依次浸入以上两个染色缸中洗涤10 min。 (4) 用0.5%的洗涤液1冲洗玻片,晾干后扫描。 |