个人认为:1. 你所使用的东存液配方是可以使用的,我自己一直使用这个配方,没有问题。2. 冻存时消化细胞是否过度造成过多细胞损伤?3. 逐级降温后的保存方式如何?-80还是液氮?如果是-80,冰箱是否断电过?是否放在冰箱深处或者靠近门口(频繁开启造成频繁冻融会损伤细胞)?放置了多长时间?4. 复苏时是否快速复温?5. 复苏后一般有两种处理方法,一种是加入10倍于冻存液体积的培养基,低速离心后传入培养皿,放置24h以上,带细胞完全贴壁后换液;另一种方法是不离心,直接用10倍于冻存液体积的培养基稀释细胞后接种培养皿,4-8h后观察细胞贴壁后换液。不知道你是怎么操作的?
考虑3个问题:1、冻存问题:胎牛比例太低,终浓度最好20%,我的冻存液一般是DMSO20%+70%FBS+10%培养液,全培吹打细胞后,加入等量冻存液,梯度冻存。复苏后有问题,是不是那一批细胞冻存时状态就不好?或者冻存前有污染?2、冻存保存:液氮罐没问题吧?是不是慢冻?3、复苏:37℃水浴快速摇晃冻存管,速融。长时间冻存的细胞,我们复苏后1天,再次传代,这样降低细胞残存的DMSO,然后细胞状态恢复的很快。做过对比,1天后再传代的细胞状态优于不传代细胞。你可以试试。还有,你提到最近复苏有问题,考虑排查下培养液、胎牛是不是跟原来一样,有没有问题~祝你好运!
我们也用的是DMSO10%+90%FBS,还有就是复苏的时候一定要快速,不能缓慢解冻
说到底还是细胞培养的问题啊,细胞养不好,就没法瞬时表达,构建稳定细胞系更难,
建议复苏后采用20%FBS培养几代,待细胞形态正常以后,再降低FBS浓度;另外,建议不要用超低温冰箱长期冻存细胞,以为超低温冰箱温度可能不够低,另外,难免会频繁打开,这样会使细胞严重受损的。建议使用液氮保存,液氮不贵的几块钱一升,可以用很久,而且还不怕停电,以前我也喜欢用超低温冰箱,自从上次停电导致所有细胞全军覆没以后,再也不敢了... ...