建立AD小鼠模型并进行基因型鉴定
获得具有早期Aβ病理的APP/PS1小鼠及对照，用于后续单细胞测序和验证实验。
使用APP/PS1小鼠（Jackson Laboratory, stock no. 34829-JAX）和C57BL/6小鼠，通过PCR对尾部DNA进行基因型鉴定。主要使用4月龄雄性小鼠（scRNA-seq每组8只，验证实验每组最多8只），另有一组8月龄小鼠用于Aβ斑块染色。
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阿尔茨海默病小鼠模型脉络丛中的早期转录和细胞异常
Early transcriptional and cellular abnormalities in choroid plexus of a mouse model of Alzheimer's disease
实验完整度
高包含单细胞转录组分析、原位免疫染色验证、体外BMDM功能实验、体内通透性测定及脂蛋白检测等多个独立证据层级，并包含功能验证和机制验证。
主要模型
4月龄雄性APP/PS1小鼠（早期Aβ病理） 4月龄雄性野生型C57BL/6小鼠（对照） 小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDM）
重点核对
APP/PS1小鼠模型（Jackson Laboratory, stock no. 34829-JAX） scRNA-seq样本：每组8只雄性小鼠，2个生物学重复（batch1: n=5, batch2: n=3） BMDM处理：Aβ单体/寡聚体/纤维（0.2-20 μM）处理48小时；LPS（500 ng/mL）预刺激6小时；4-IPP（100 μM）处理48小时 dextran注射：5 mg/mL，4.5 μL/只，速率500 nL/min 统计分析：双尾学生t检验、双因素方差分析，P<0.05
摘要
背景：阿尔茨海默病（AD）是一种进行性神经退行性疾病，其特征是淀粉样β斑块积聚、tau过度磷酸化和神经炎症。脉络丛（ChP）作为血液-脑脊液-脑屏障，在对应激的免疫反应和脑稳态中发挥重要作用。然而，ChP对AD进展的细胞和分子贡献仍不完全清楚。方法：为阐明AD早期的分子异常，我们从具有早期Aβ病理的APP/PS1小鼠和同窝对照中获取了ChP的单细胞转录谱。通过差异表达基因、细胞间通讯和伪时间轨迹分析，鉴定了每种细胞类型中发生的转录改变。随后通过一系列原位和体外实验验证了这些发现。结果：我们构建了ChP在单细胞分辨率下的全面图谱，并在雄性小鼠中鉴定了六种主要细胞类型和免疫亚群。与野生型（WT）小鼠相比，APP/PS1小鼠上皮细胞中大多数失调基因被发现，且这些基因大多属于下调模块，涉及线粒体呼吸体组装、纤毛组织和屏障完整性。上皮屏障的破坏导致APP/PS1小鼠中巨噬细胞迁移抑制因子（MIF）分泌下调，导致巨噬细胞活化并增强对Aβ的吞噬。同时，巨噬细胞和其他ChP细胞分泌的配体（如APOE）促进脂质进入室管膜细胞，导致脂质积累和脑实质中小胶质细胞的活化。结论：总之，这些数据描绘了AD小鼠模型中ChP的早期转录和细胞异常，为AD病理生物学中的脑血管提供了新的见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 脉络丛（ChP）在阿尔茨海默病早期阶段的细胞和分子异常及其对AD进展的贡献是什么？
- 核心机制
- ChP上皮细胞功能障碍（包括MIF下调）导致巨噬细胞M1极化增强，而ChP来源的APOE与室管膜细胞LRP1等受体相互作用，促进脂质进入脑实质，导致脂质积累和小胶质细胞活化，从而加剧AD病理。
- 主要证据
- 通过单细胞RNA测序发现上皮细胞中大量基因下调，并通过免疫染色验证了纤毛密度减少、UQCRB表达降低和EZR极性丧失；通透性实验显示血-CSF屏障受损；BMDM实验证实MIF抑制增强Aβ吞噬和炎症；脂蛋白测量显示皮层中HDL、LDL和VLDL增加。
- 研究意义
- 这些发现将ChP定位为AD早期病理的调控枢纽，为理解AD的脑血管病理生物学提供了新见解，并为开发靶向ChP的早期干预策略奠定了基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
ChP组织分离和单细胞悬液制备
从ChP组织中获取高质量单细胞，用于单细胞RNA测序。
处死小鼠后，解剖取出侧脑室和第四脑室的ChP，合并3-5只小鼠的组织，置于组织保存液中。用组织解离系统消化，过滤去除碎片，裂解红细胞，最终获得单细胞悬液。
单细胞RNA测序文库构建和测序
获得ChP单细胞转录组数据，用于后续分析。
使用Singleron Matrix®单细胞处理系统加载细胞，构建文库并在Illumina NovaSeq 6000平台上测序。
scRNA-seq数据处理、质量控制与细胞类型鉴定
将测序数据处理为表达矩阵，去除低质量细胞和双细胞，并鉴定主要细胞类型。
使用CeleScope v1.2.1处理原始数据，包括去除低质量读段、比对到参考基因组GRCm39、生成UMI计数矩阵。使用Seurat v4.2.1进行质量控制、归一化、PCA、UMAP聚类，并通过规范标记物鉴定细胞类型。
差异表达基因和富集分析
识别APP/PS1小鼠与WT小鼠ChP各细胞类型的差异表达基因，并分析其生物学通路。
使用Seurat FindMarkers函数（MAST方法）鉴定DEGs，使用Metascape进行GO生物学过程富集分析。
细胞间通讯和伪时间轨迹分析
分析ChP内细胞间通讯变化以及巨噬细胞极化轨迹。
使用CellChat分析细胞间配体-受体相互作用，使用slingshot构建巨噬细胞M2至M1的伪时间轨迹，并鉴定沿轨迹变化的基因。
原位免疫染色验证
验证scRNA-seq发现的细胞类型和关键蛋白表达变化。
使用免疫荧光染色和多重免疫组化（mIHC）检测ChP中OTX2、PECAM1、ACTA2、ARL13B、γ-tubulin、UQCRB、EZR、MIF、CD68、IBA1、APOE、LRP1等蛋白的表达。
通透性测定
评估AD小鼠ChP屏障功能是否受损。
通过脑室内注射荧光标记的dextran，测量血浆中dextran水平以评估血-CSF屏障通透性。
体外BMDM实验
验证MIF在Aβ诱导的巨噬细胞炎症和吞噬中的作用。
从4月龄雄性WT小鼠骨髓中分化BMDMs，用Aβ聚集体（单体/寡聚体/纤维）处理，并用MIF抑制剂4-IPP和LPS处理，检测TNF-α和IL-1β分泌以及Aβ吞噬能力。
脂蛋白颗粒测量
验证ChP功能障碍是否导致脑实质脂质积累。
从脑皮层组织制备不溶性蛋白组分，使用ELISA测量HDL、LDL和VLDL的水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
验证免疫效应
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 组织解离 | 无酚红DMEM培养基 | Servicebio | G4525 |
| sCelLive™组织保存液 | Singleron | -- | |
| Hank's平衡盐溶液 | Servicebio | G4205 | |
| sCelLive™组织解离液 | Singleron | -- | |
| GEXSCOPE®红细胞裂解液 | Singleron | -- | |
| scRNA-seq | Singleron Matrix®单细胞处理系统 | Singleron Biotechnologies | -- |
| Illumina NovaSeq 6000测序仪 | Illumina | -- | |
| 免疫染色 | DAPI | Meilunbio | MB3204 |
| 抗荧光淬灭封片剂 | SouthernBiotech | -- | |
| 柠檬酸抗原修复液 | MXB biotechnologies | MVS-0101 | |
| 牛血清白蛋白 | Macklin | C16766338 | |
| 驴血清 | Solarbio | SL050 | |
| 山羊血清 | Solarbio | SL038 | |
| iF488-TSA | Servicebio | G1231 | |
| iF647-TSA | Servicebio | G1232 | |
| 过氧化氢 | -- | -- | |
| 吐温-20 | Sangon Biotech | 9005-64-5 | |
| TissueFAXS光谱系统 | TissueGnostics GmbH | -- | |
| BMDM实验 | Aβ42肽 | China Peptides | 04010043259 |
| 六氟异丙醇 | Aladdin | H107503 | |
| 二甲基亚砜 | Beyotime | ST038 | |
| RPMI-1640培养基 | Gibco | 11875093 | |
| 胎牛血清 | Gibco | 10099–141 | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | 15140122 | |
| β-巯基乙醇 | Sigma-Aldrich | M274256 | |
| 脂多糖 | Sigma | L2630 | |
| 4-碘-6-苯基嘧啶 | MedChemExpress | 41270966 | |
| TNF-α ELISA试剂盒 | Elabscience | EELM3063 | |
| IL-1β ELISA试剂盒 | Elabscience | EELM0037 | |
| 4G8抗Aβ单克隆抗体 | Biolegend | 800701 | |
| 通透性测定 | 葡聚糖（D1818） | ThermoFisher | D1818 |
| 立体定位仪 | RWD Life Science | 68802 | |
| Synergy H1微孔板读板器 | BioTek | -- | |
| 脂蛋白测量 | 超速离心管 | Berkman | 342303 |
| 超速离心机 | Beckman Coulter | Optima™ | |
| HDL ELISA试剂盒 | FineTest | EM1113 | |
| LDL ELISA试剂盒 | FineTest | EM1184 | |
| VLDL ELISA试剂盒 | FineTest | EM1863 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型 | 小鼠品系、年龄、性别、基因型鉴定方法、饲养环境 阅读提示：Methods: Animals |
| ChP组织分离和单细胞制备 | 组织采集方法、合并的动物数量、消化条件、红细胞裂解条件 阅读提示：Methods: Isolation and dissociation of ChP |
| scRNA-seq文库构建和测序 | 测序平台、读长、细胞加载数量 阅读提示：Methods: Library construction and sequencing |
| scRNA-seq数据分析 | 参考基因组、比对软件、质量控制标准、双细胞去除方法、批次效应处理 阅读提示：Methods: Raw data processing, quality control, and cell type identification; DEG and enrichment analysis; Cell–cell communication and pseudotime trajectory analyses |
| 免疫染色 | 组织固定、切片厚度、抗原修复方法、抗体稀释度、孵育时间 阅读提示：Methods: Immunostaining |
| 通透性测定 | 注射剂量、速率、坐标、血浆收集时间、检测方法 阅读提示：Methods: Permeability measurement by intracerebroventricular injection of dextran |
| BMDM实验 | 细胞来源、分化条件、Aβ制备和浓度、处理时间、MIF抑制剂和LPS浓度 阅读提示：Methods: Mouse bone marrow-derived macrophages preparation, treatment, and detection |
| 脂蛋白测量 | 组织来源、不溶性蛋白制备步骤、离心条件、ELISA试剂盒 阅读提示：Methods: Insoluble protein preparation and lipoprotein particle measurement |