饮食预处理与进食行为测定
确定不同宏量营养素预喂对后续食物选择的影响
雌性果蝇先用酵母（10%）或蔗糖（10%）饮食预喂15小时，然后通过染料摄入、CAFÉ、FLIC和flyPAD等方法测量对糖、酵母、脂质等食物的摄入量。
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蛋白质响应的肠道激素速激肽指导食物选择并影响寿命
Protein-responsive gut hormone tachykinin directs food choice and impacts lifespan
实验完整度
高包含果蝇体内行为实验（进食、睡眠、寿命）、钙成像、基因敲降/过表达、小鼠肠道类器官及体内饮食干预等多个证据层级，并进行功能验证和机制验证。
主要模型
果蝇成虫（雌性为主） 小鼠小肠类器官 雌性C57BL/6J小鼠 Tph1-CFP转基因小鼠来源的肠嗜铬细胞
重点核对
果蝇Tk+ EECs中Tk、slif、Tor、TrpA1的敲降对食物选择和睡眠的影响 小鼠肠道类器官中TOR抑制剂Torin1和TRPA1激动剂/拮抗剂对Tac1表达和SP水平的影响 小鼠低蛋白和高蛋白饮食对回肠Tac1表达和血浆SP水平的影响 果蝇APC中TkR99D和Akh敲降对进食和睡眠的影响
摘要
动物根据反映动态宏量营养素需求的饥饿感来选择食物，但营养素特异性食欲调节背后的激素机制仍不明确。在这里，我们确定了速激肽（Tk）是果蝇和雌性小鼠中一种蛋白质响应的肠道激素，受保守的环境和营养感应机制调控。蛋白质摄入激活表达Tk的肠内分泌细胞（EECs），通过涉及雷帕霉素靶蛋白（TOR）和瞬时受体电位A1（TrpA1）的机制驱动肠道Tk的释放。在果蝇中，我们描绘了一条通路，肠道Tk通过该通路控制蛋白质摄入后的选择性食欲和睡眠，该通路由胰高血糖素样脂肪动员激素（AKH）信号传导至神经元和脂肪组织介导。该机制抑制蛋白质食欲，促进糖饥饿，并调节觉醒以协调行为与营养需求。抑制蛋白质响应的肠道Tk通过AKH延长寿命，揭示了营养依赖性肠道激素信号在长寿中的作用。我们的结果为理解EEC来源的营养素特异性饱腹信号以及肠道激素在调节食物选择、睡眠和寿命中的作用提供了一个框架。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 蛋白质摄入如何通过肠道激素信号调节营养特异性食欲、食物选择、睡眠和寿命？
- 核心机制
- 蛋白质摄入通过Slif和TOR通路激活果蝇Tk+ EECs释放Tk，Tk作用于APC上的TkR99D促进AKH释放，AKH通过神经元（特别是胆碱能神经元）和脂肪组织中的AkhR信号抑制蛋白质食欲、促进糖食欲并调节觉醒；在小鼠中，TOR和TRPA1调节肠嗜铬细胞中Tac1表达和SP释放。
- 主要证据
- 果蝇中Tk、slif、Tor、TrpA1的敲降或激活影响进食行为、睡眠和寿命；APC中TkR99D或Akh敲降模拟Tk敲降表型；小鼠肠道类器官中Torin1和TRPA1调节Tac1/SP，高蛋白饮食增加回肠Tac1表达和血浆SP水平。
- 研究意义
- 该研究揭示了EEC来源营养素特异性饱腹信号的机制，以及肠道激素在调节食物选择、睡眠和寿命中的作用，为理解代谢紊乱和衰老的潜在干预策略提供了基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
Tk+肠内分泌细胞活性与Tk释放检测
验证蛋白质/氨基酸摄入是否激活Tk+ EECs并促进Tk释放
使用CaLexA和GCaMP6s报告系统检测Tk+ EECs的钙活性，并通过免疫组化染色检测细胞内Tk肽水平。
氨基酸感应通路（Slif和TOR）和ROS/TrpA1调控Tk释放
探究Tk+ EECs感知氨基酸和ROS并调控Tk释放的分子机制
在Tk+ EECs中敲降slif、Tor、Gcn2、TrpA1等基因或过表达Tsc1/Tsc2，检测Tk肽水平和Tk转录水平。
小鼠肠道类器官和体内验证Tk调控
验证TOR和TRPA1对小鼠肠道Tac1/SP的调控以及蛋白质饮食的影响
使用小鼠肠道类器官，用Torin1、TRPA1激动剂CNA、拮抗剂A-967079处理，检测Tac1表达和SP水平；给小鼠喂低蛋白或高蛋白饮食，检测回肠Tac1表达和血浆SP水平。
AKH信号通路介导Tk对进食和睡眠的影响
确定Tk是否通过TkR99D和AKH信号影响进食行为和睡眠
在APC中敲降TkR99D或Akh，或在神经元和脂肪组织敲降AkhR，检测进食行为（染料、CAFÉ、FLIC、flyPAD）和睡眠。
繁殖力与寿命测定
探究Tk和AKH信号对繁殖力和寿命的影响
测量不同基因型果蝇的繁殖力（后代数量）和寿命（存活曲线）。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 进食测定（染料法） | 亮蓝 | Sigma-Aldrich | 861146 |
| 细胞培养 | 基质胶 | Corning | 354230 |
| Advanced DMEM/F12培养基 | Gibco | -- | |
| WNT3A条件培养基 | -- | -- | |
| R-spondin1条件培养基 | Trevigen | -- | |
| 药物处理 | Torin1 | Sigma-Aldrich | 475991 |
| A-967079 | Sigma-Aldrich | A-967079 | |
| 肉桂醛 | Sigma-Aldrich | W228613 | |
| RNA提取 | NucleoSpin RNA提取试剂盒 | Macherey-Nagel | 740955 |
| cDNA合成 | High-Capacity cDNA合成试剂盒 | Applied Biosystems | 4368814 |
| qPCR | RealQ Plus 2× SYBR Green预混液 | Ampliqon | A324402 |
| QuantStudio 5实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| 代谢物测定 | 甘油三酯试剂 | Sigma | T2449 |
| 游离甘油试剂 | Sigma | F6428 | |
| 淀粉葡糖苷酶 | Sigma | A7420 | |
| 葡萄糖测定试剂盒 | Sigma | GAGO20 | |
| 二辛可宁酸溶液 | Sigma | B9643 | |
| 硫酸铜溶液 | Sigma | C2284 | |
| 免疫组化 | 抗GFP抗体 | Thermo Fisher | A11120 |
| 抗mCherry抗体 | Thermo Fisher | M11217 | |
| 抗Tk抗体 | -- | -- | |
| 抗AKH抗体 | -- | -- | |
| Alexa Fluor 488标记山羊抗小鼠二抗 | Thermo Fisher | A32723 | |
| Alexa Fluor 555标记山羊抗大鼠二抗 | Thermo Fisher | A21434 | |
| Alexa Fluor 594标记山羊抗兔二抗 | Thermo Fisher | A11012 | |
| Alexa Fluor Plus 647标记山羊抗兔二抗 | Thermo Fisher | A32733 | |
| ProLong Glass抗淬灭封片剂 | Invitrogen | 36984 | |
| 含DAPI的Fluoroshield封片剂 | Sigma | F6057 | |
| Vectashield抗淬灭封片剂 | Vector Laboratories | H-1200 | |
| 多聚赖氨酸 | Sigma | P8920 | |
| SecureSeal粘性成像垫片 | Grace Bio-Labs | 654006 | |
| 玻璃底培养皿 | MatTek | P35G-0-10-C | |
| Alexa Fluor 647标记鬼笔环肽 | Thermo Fisher | A30107 | |
| 成像 | Zeiss LSM 900共聚焦显微镜 | Zeiss | -- |
| 图像分析 | ImageJ软件 | -- | -- |
| MATLAB软件 | MathWorks | -- | |
| 原位杂交 | HCR探针 | Molecular Instruments | -- |
| HCR缓冲液套装 | Molecular Instruments | -- | |
| 20× SSC缓冲液浓缩液 | Sigma | S6639 | |
| 吐温-20 | Sigma | P1379 | |
| 蛋白检测 | SP竞争性ELISA试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | EEL013 |
| 血液处理 | 肝素管 | -- | -- |
| 饮食干预 | 低蛋白饮食 (D11092301) | Research Diets | -- |
| 高蛋白饮食 (D11051801) | Research Diets | -- | |
| 细胞培养 | TrypLE Express消化液 | Invitrogen | 12605010 |
| DMEM培养基（高糖，GlutaMAX） | Gibco | 31966021 | |
| DMEM培养基 | Sigma-Aldrich | D6546 | |
| 博来霉素 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| ROCK抑制剂 | -- | -- | |
| 动物实验 | Tph1-CFP小鼠 | Jackson Laboratory | 028366 |
| C57BL/6J小鼠 | Taconic | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 进食行为测定 | 果蝇品系及性别、预喂饮食（10%酵母或10%蔗糖）及时长（15小时）、进食测定方法（染料摄入、CAFÉ、FLIC、flyPAD）及时间 阅读提示：Methods 中 'Fly stocks and maintenance' 和 'Feeding assays' 部分 |
| Tk+ EEC活性检测 | 报告系统（CaLexA、GCaMP6s）及驱动品系（Tkgut>）、饮食处理（糖、酵母、氨基酸等）及时长（3-18小时）、成像设置 阅读提示：Methods 中 'Immunohistochemistry and confocal imaging' 和 'Calcium imaging' 部分 |
| 基因操作 | RNAi品系及来源（VDRC、TRiP等）、GAL4驱动品系（Tkgut>、Akh>等）、GAL80抑制（R57C10-GAL80）、对照品系 阅读提示：Methods 中 'Fly stocks and maintenance' 及补充表1 |
| 小鼠类器官实验 | 小鼠品系（Tph1-CFP）、类器官培养条件（Matrigel、ENR/WENR培养基）、药物处理（Torin1、A-967079、CNA）浓度及时间 阅读提示：Methods 中 'Mouse small intestinal organoid culture' 和 'Drug treatments of organoids and two-dimensional monolayer cultures' 部分 |
| 小鼠饮食干预 | 小鼠品系、性别、年龄、饮食（低蛋白/高蛋白）及持续时间（1、3、7天）、组织采集（回肠）、血浆SP检测方法 阅读提示：Methods 中 'Mouse dietary interventions and sample collection for gut hormone analysis' 部分 |
| 睡眠监测 | 果蝇品系、性别、年龄、饮食（5%蔗糖或5%酵母）、监测设备（DAM系统）、数据分析方法（睡眠定义） 阅读提示：Methods 中 'Sleep and activity assays' 部分 |
| 寿命与繁殖力 | 果蝇品系、性别、交配状态、饮食（酵母浓度）、每管数量、记录间隔 阅读提示：Methods 中 'Longevity assay' 和 'Fecundity assay' 部分 |