慢性社会挫败应激模型建立及行为表型鉴定
建立应激敏感（SS）和应激韧性（RES）小鼠模型，以研究韧性相关机制。
雄性C57BL/6小鼠接受10天CSDS，每天5分钟身体对抗，随后进行社会交互（SI）测试，根据SI比值大于或小于1.0分为RES或SS。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
星形胶质细胞大麻素受体1通过抑制应激诱导的血脑屏障改变促进心理韧性
Astrocytic cannabinoid receptor 1 promotes resilience by dampening stress-induced blood-brain barrier alterations
实验完整度
高包含行为学、病毒介导的基因操作、免疫荧光、超分辨显微镜、转录组学、细胞培养及人脑样本验证等多个独立证据层级，并有明确的功能验证和机制验证。
主要模型
成年雄性C57BL/6小鼠 慢性社会挫败应激（CSDS）模型 小鼠原代星形胶质细胞培养 重度抑郁症（MDD）男性患者脑组织样本
重点核对
CSDS范式：10天，每天5分钟身体社交挫败，CD-1攻击者 AAV注射：NAc壳部双侧注射，剂量0.5µl，1×10^11 IU/ml 行为测试时间点：病毒表达3周后进行行为测试 IL-6处理浓度：100 ng/ml，急性（3h/6h/24h）和慢性（7天）处理 统计方法：ANOVA、非参数检验、相关性分析，P<0.05视为显著
摘要
血脑屏障（BBB）的改变有助于应激脆弱性和抑郁行为的发展。相反，支持应激韧性的神经血管适应仍不清楚。在此，我们报道了在成年雄性小鼠的慢性社会应激期间，伏隔核（NAc）壳部星形胶质细胞大麻素受体1（CB1）的高表达，特别是在包裹血管的终足中，与韧性相关。病毒介导的NAc壳部星形胶质细胞中Cnr1的过表达在雄性小鼠中产生基线抗焦虑效应，并抑制应激诱导的焦虑和抑郁样行为。它促进血管相关基因的表达，并在细胞因子白细胞介素-6（与应激易感性和情绪障碍相关）的免疫挑战后减少星形胶质细胞的炎症反应和形态学变化。体育锻炼和抗抑郁治疗增加雄性小鼠血管周围区域星形胶质细胞Cnr1的表达。在患有重度抑郁症的男性供体的人体组织中，我们观察到NAc星形胶质细胞中CNR1的缺失。我们的研究结果表明，星形胶质细胞的内源性大麻素系统通过调节血脑屏障在应激反应中发挥作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 星形胶质细胞CB1受体是否通过调节血脑屏障功能参与应激韧性？
- 核心机制
- 星形胶质细胞CB1激活促进血管相关基因表达，抑制炎症反应，维持血脑屏障完整性，从而促进应激韧性。
- 主要证据
- 通过AAV介导的Cnr1过表达和敲低、CSDS模型、行为测试、免疫荧光、转录组学、体外IL-6处理及人脑样本验证，表明NAc壳部星形胶质细胞CB1上调足以产生抗焦虑和抗抑郁效应，并减少应激诱导的BBB损伤。
- 研究意义
- 揭示星形胶质细胞CB1作为应激韧性调节因子，为治疗情感障碍提供潜在新靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检测应激后NAc壳部星形胶质细胞CB1表达变化
比较RES与SS小鼠NAc壳部星形胶质细胞CB1表达水平，评估其与韧性的关联。
使用免疫荧光染色和共聚焦显微镜定量NAc壳部S100β+星形胶质细胞中CB1蛋白水平，以及Cnr1 mRNA表达（qPCR和TaqMan阵列）。
病毒介导的星形胶质细胞Cnr1过表达的功能验证
检验NAc壳部星形胶质细胞Cnr1过表达是否影响焦虑和抑郁样行为，并促进应激韧性。
向NAc壳部双侧注射AAV-GFAP-Cnr1或对照病毒，3周后进行一系列行为测试（包括OF、EPM、ST、SPT、FST、TST），随后进行CSDS并重复行为测试。
病毒介导的星形胶质细胞Cnr1敲低的功能验证
检验NAc壳部星形胶质细胞Cnr1敲低是否消除韧性并增加应激易感性。
注射AAV-GFAP-shmir-Cnr1或对照scramble病毒，然后进行CSDS和行为测试。
血脑屏障损伤对星形胶质细胞Cnr1表达的影响
评估BBB损伤是否诱导CB1表达增加，并探究其与BBB维持的关系。
通过AAV-shRNA-Cldn5敲低Cldn5诱导BBB损伤，检测Cnr1和Aqp4表达变化，并用Imaris分析血管覆盖。
转录组学和通路分析
揭示Cnr1过表达后星形胶质细胞转录组变化，寻找与BBB维持相关的通路。
从CSDS后小鼠NAc中FACS分选GFP+星形胶质细胞，进行RNA-seq，分析差异表达基因和通路。
内源性大麻素水平检测
检测CSDS后NAc和纯化星形胶质细胞中2-AG和AEA水平，并与行为表型关联。
使用HPLC-MS/MS测量NAc组织和MACS纯化的星形胶质细胞中2-AG和AEA水平。
体外星形胶质细胞炎症模型
研究IL-6对星形胶质细胞形态、炎症反应和CB1表达的影响，以及Cnr1过表达的保护作用。
用IL-6处理原代小鼠星形胶质细胞（急性或慢性），检测炎症基因表达、细胞形态（GFAP面积）和Cnr1表达；部分细胞感染AAV-GFAP-Cnr1。
体育锻炼和抗抑郁治疗对Cnr1表达的影响
检验体育锻炼和抗抑郁治疗是否通过上调星形胶质细胞Cnr1来促进韧性。
小鼠在CSDS期间自由使用跑轮，评估SI行为和Cnr1表达；另一组CSDS后SS小鼠接受抗抑郁药（丙咪嗪或氟西汀）治疗，检测Cnr1表达和Aqp4相关性。
人类样本验证
验证MDD患者NAc中星形胶质细胞CNR1表达变化。
使用RNAscope对男性MDD和对照组NAc组织切片进行CNR1和AQP4共标记，定量分析CNR1+星形胶质细胞。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 行为学测试 | AnyMaze软件 | Stoelting | 6.1 and 7.02 |
| Ethovision软件 | -- | v17 | |
| 慢性社会挫败应激 | 社交挫败笼 | Allentown | -- |
| 免疫组化 | 抗Aqp4抗体 | Synaptic Systems | 429004 |
| 抗CD31抗体 | Thermo Fisher Scientific | 14-0311-85 | |
| 抗S100β抗体 | Synaptic Systems | 287004 | |
| 抗MAP2抗体 | Millipore | 05-346-MI | |
| 抗CB1R抗体 | Abcam | AB23703 | |
| 抗NeuN抗体 | Millipore | MAB377 | |
| 抗cFos抗体 | Abcam | ab209794 | |
| DAPI | -- | -- | |
| ProLong Diamond抗淬灭封片剂 | Invitrogen | -- | |
| 共聚焦显微镜 | LSM 700共聚焦显微镜 | Carl Zeiss | ZEN v.3.1 |
| STED显微镜 | STED显微镜（Expert Line） | Abberior Instruments GmbH | -- |
| 图像分析 | Imaris软件 | Oxford Instruments | 9.7.2, 9.9.1, 10.2 |
| 病毒构建 | AAV2/5-GFAP-Cnr1-eGFP | CERVO Molecular Platform | -- |
| AAV2/5-GFAP-eGFP | CERVO Molecular Platform | -- | |
| AAV5-GFAP-GFP-shRNAmir(Cnr1) | SignaGen Laboratories | -- | |
| AAV5-GFAP-GFP-shRNAmir(Scrm) | SignaGen Laboratories | -- | |
| AAV9-hSyn-GFP-shRNAmir(Cnr1) | SignaGen Laboratories | -- | |
| AAV9-hSyn-GFP-shRNAmir(Scrm) | SignaGen Laboratories | -- | |
| AAV2/9-shRNA-Cldn5 | -- | -- | |
| AAV2/9-shRNA | -- | -- | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| Pure Link RNA试剂盒 | Life Technologies | -- | |
| qPCR | Maxima-H-minus cDNA合成试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Power Up SYBR Green | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| PrimeTime qPCR引物 | Integrated DNA Technologies | -- | |
| QuantStudio | Thermo Fisher Scientific | v1.5.2 | |
| TaqMan Array | RNeasy Plus Mini试剂盒 | Qiagen | -- |
| iScript cDNA合成试剂盒 | Bio-Rad | -- | |
| QuantStudio 12K Flex实时荧光定量PCR系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| HPLC-MS/MS | HPLC色谱柱（Kinetex C8，150 × 2.1 mm，2.6 μm） | Phenomenex | -- |
| 岛津8050三重四极杆质谱仪 | Shimadzu | -- | |
| FACS | 神经组织解离试剂盒 | Miltenyi Biotec | -- |
| MACS智能过滤器（70μm） | Miltenyi Biotec | -- | |
| ACSA2 APC抗体 | Miltenyi Biotec | 130-116-244 | |
| CD45 PECy7抗体 | Invitrogen | 25-0451-81 | |
| CD11b PE抗体 | Invitrogen | 12-0112-81 | |
| CD31 PECY7抗体 | BioLegend | 102417 | |
| LIVE/DEAD可固定绿色荧光染料 | Molecular Probes | L34969 | |
| 抗GFP PE抗体 | BioLegend | 338004 | |
| BD LSR II流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| RNA提取（FACS） | PicoPure RNA提取试剂盒 | Arcturus | KIT0202 |
| MACS | 神经元组织解离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-092-628 |
| Acsa2微珠 | Miltenyi Biotec | 130-097-679 | |
| MACS MS柱 | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| 细胞培养 | 高糖DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 表皮生长因子 | Gibco | -- | |
| 成纤维细胞生长因子 | Gibco | -- | |
| 多聚-D-赖氨酸 | Millipore | A-003-E | |
| TrpLE消化液 | Gibco | -- | |
| 细胞处理 | 重组IL-6 | Life Technologies | RMIL6I |
| 2-花生四烯酸甘油酯 | Cayman Chemical | -- | |
| MTT | Millipore Sigma | -- | |
| RNA-seq | NEBNext单细胞低输入RNA文库制备试剂盒 | New England BioLabs | -- |
| KAPA文库定量试剂盒 | Kapa Biosystems | -- | |
| 片段分析仪 | Agilent | -- | |
| Illumina NovaSeq X Plus测序平台 | Illumina | -- | |
| NanoDrop分光光度计ND-1000 | NanoDrop Technologies | -- | |
| 2100生物分析仪 | Agilent Technologies | -- | |
| LabChip GXII | PerkinElmer | -- | |
| 脑立体定位手术 | 脑立体定位仪 | Harvard Apparatus | -- |
| 30号注射针 | Hamilton | -- | |
| 抗抑郁治疗 | 丙咪嗪 | -- | -- |
| 氟西汀 | -- | -- | |
| 运动干预 | 跑轮 | Med Associates | -- |
| Wheel Manager软件 | Med Associates | -- | |
| RNAscope | Multiplex荧光检测试剂V2 | Advanced Cell Diagnostics | -- |
| RNAscope探针Hs-CNR1-C3 | Advanced Cell Diagnostics | 591521-C3 | |
| RNAscope探针Hs-AQP4-C2 | Advanced Cell Diagnostics | 482441-C2 | |
| RNAscope探针Hs-RBFOX3 | Advanced Cell Diagnostics | 415591 | |
| TSA Vivid荧光染料520nm | Advanced Cell Diagnostics | 323271 | |
| TSA Vivid荧光染料570nm | Advanced Cell Diagnostics | 323272 | |
| TSA Vivid荧光染料650nm | Advanced Cell Diagnostics | 323273 | |
| RNAscope探针Mm-Cnr1-C3 | Advanced Cell Diagnostics | 420721-C3 | |
| RNAscope探针Mm-Rbfox3 | Advanced Cell Diagnostics | 313311 | |
| RNAscope探针Mm-Gfap-C2 | Advanced Cell Diagnostics | 313211-C2 | |
| 免疫印迹 | 抗GFAP抗体 | Synaptic Systems | 173004 |
| 抗Aqp4抗体（EMD Millipore） | Thermo Fisher Scientific | AB2218MI | |
| 动物实验 | C57BL/6小鼠 | Charles River Laboratories | -- |
| CD-1小鼠 | Charles River Laboratories | -- | |
| 多西环素 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| CSDS模型 | 雄性C57BL/6小鼠，10天CSDS，每天5分钟身体对抗，CD-1攻击者；SI比值<1.0为易感，>1.0为韧性 阅读提示：Methods: CSDS, SI test |
| 病毒注射 | AAV-GFAP-Cnr1或AAV-GFAP-sham，NAc壳部双侧注射，0.5µl，滴度1×10^11 IU/ml；行为测试在3周后 阅读提示：Methods: Stereotactic surgeries |
| IL-6处理 | IL-6浓度100 ng/ml，急性处理3h/6h/24h，慢性处理7天；Cnr1过表达可预防IL-6诱导的形态变化 阅读提示：Methods: Astrocytes exposure to pro-inflammatory IL-6 |
| 免疫荧光定量 | 一抗稀释：Aqp4 1:200，CD31 1:100，S100β 1:250，MAP2 1:300，CB1 1:200，NeuN 1:500，cFos 1:200；使用Imaris分析共定位 阅读提示：Methods: Immunohistochemistry |
| RNA-seq | FACS分选GFP+星形胶质细胞，RNA-seq分析，差异基因筛选标准FC±2, P<0.05 阅读提示：Methods: RNA sequencing |
| HPLC-MS/MS | 检测NAc组织和纯化星形胶质细胞中2-AG和AEA水平，样品制备和仪器设置详见方法 阅读提示：Methods: Endocannabinoid content measurement |