Engineered oncolytic virus coated with anti-PD-1 and alendronate for ameliorating intratumoral T cell hypofunction
研究包含体外细胞实验（感染、细胞毒性、凋亡、增殖、巨噬细胞清除）、体内正交小鼠模型（GL261和U87）验证疗效和免疫调节，并涉及TCGA及单细胞数据分析和临床样本验证，多个独立证据层级且包含功能验证。
GL261小鼠胶质瘤原位模型（免疫活性C57BL/6小鼠） U87胶质瘤原位异种移植模型（免疫缺陷BALB/c裸鼠） U87、GL261、U251等胶质瘤细胞系 TCGA及单细胞RNA-seq数据队列
细胞实验使用的MOI（感染复数）具体数值，文中未明确说明 体内实验给药剂量：OV为3×10^7 PFU/只，抗PD-1为3 mg/kg，阿仑膦酸给药方式为口服，但剂量文中未明确说明 体内实验中每组小鼠数量：生存期实验每组7只，其他实验每组3只 体内实验给药时间：肿瘤接种后第10天单次治疗 体外实验中病毒处理时间（如CCK-8实验为48小时，EdU为24小时，凋亡分析为24小时）
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证CD46在胶质瘤中的表达水平及其与预后的关系，为使用Ad5/35嵌合纤维溶瘤病毒靶向胶质瘤提供依据。
利用TCGA数据库、单细胞RNA-seq数据（GSE131928）分析CD46在不同肿瘤和胶质瘤亚型中的表达，进行Kaplan-Meier生存分析；通过qRT-PCR和免疫印迹检测不同级别胶质瘤组织（WHO II-IV）及非肿瘤脑组织中CD46 mRNA和蛋白表达；通过流式细胞术分析多种胶质瘤细胞系中CD46和CAR的表达。
制备ROS响应性纳米载体，并验证其理化性质及在肿瘤微环境中的响应性释放能力。
合成酰化阿仑膦酸和ROS响应交联剂，通过自由基聚合将APM、ROS响应交联剂、酰化抗PD-1和酰化阿仑膦酸包被到OV表面。使用DLS测量粒径和Zeta电位，TEM观察形貌，评估其在脑脊液中的稳定性，并测定在PBS或含H2O2条件下的药物释放曲线。
评估PD-1/Al@OV对胶质瘤细胞的感染能力、细胞毒性、凋亡诱导和增殖抑制作用，以及对巨噬细胞（Raw264.7）的清除作用。
用表达EGFP的OVs感染U87、GL261等细胞，通过荧光显微镜和免疫印迹检测感染效率；用CCK-8测定不同MOI下对肿瘤细胞和正常细胞的细胞毒性；用Annexin V-FITC/PI染色流式分析凋亡；用EdU实验评估增殖；用CCK-8检测对Raw264.7细胞活性的影响。
验证PD-1/Al@OV在免疫活性（GL261）和免疫缺陷（U87）原位胶质瘤模型中的抗肿瘤效果、病毒滞留时间及安全性。
构建原位GL261和U87胶质瘤模型，将PD-1/Al@OV及对照药物瘤内注射，通过IVIS监测病毒滞留和肿瘤生长，记录生存期，进行H&E染色和TUNEL分析，并检测主要脏器的毒性。
评估PD-1/Al@OV对肿瘤免疫微环境的调节作用，包括对巨噬细胞、T细胞亚群和细胞因子的影响。
在GL261原位模型治疗后第17天，取脑肿瘤组织制备单细胞悬液，通过流式细胞术检测CD45+、CD11b+、F4/80+巨噬细胞和CD3+、CD4+、CD8+ T细胞比例；通过免疫组化检测F4/80、CD3、CD8、FOXP3阳性细胞；通过ELISA检测IFN-γ、IL-1β和IL-6水平。
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 材料合成 | 1,1'-羰基二咪唑 | Sigma-Aldrich | 21860 |
| 甲基丙烯酸2-羟乙酯 | Sigma-Aldrich | 128635 | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | WISENT | 319-005-CL |
| 胎牛血清 | WISENT | 086150 | |
| 凋亡检测 | Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒 | BD Pharmingen | CB05850284 |
| qRT-PCR | cDNA逆转录试剂盒 | Yeasen Biotechnology | 11119ES60 |
| 细胞活力检测 | CCK-8检测试剂盒 | MedChemExpress | HY-K0301 |
| 细胞增殖检测 | EdU检测试剂盒 | Ribo Biotechnology | C10310-1 |
| ELISA | IFN-γ ELISA检测试剂盒 | Absin | abs520007 |
| IL-1β ELISA检测试剂盒 | Absin | abs520001 | |
| IL-6 ELISA检测试剂盒 | Absin | abs520004 | |
| 流式细胞术 | 抗CD46-APC抗体 | Biolegend | 352405 |
| 抗CD45-BV650抗体 | BD Pharmingen | 563410 | |
| 抗F4/80-PE抗体 | BD Pharmingen | 565410 | |
| 抗CD11b-FITC抗体 | BD Pharmingen | 554861 | |
| FITC标记抗CD8a抗体 | BD Pharmingen | 553030 | |
| 免疫组化 | 抗CD3抗体 | Bio X cell | BE0002 |
| 药物处理 | 抗PD-1抗体 | Biolegend | 135233 |
| 免疫组化 | 抗CD8抗体 | Bio X cell | BE0118 |
| 抗F4/80抗体 | Bio X cell | BE0206 | |
| 抗Foxp3抗体 | Abcam | ab75763 | |
| 免疫印迹 | 抗CD46抗体 | Absin | abs136051 |
| 流式细胞术 | 抗CAR抗体 | Thermo | PA5-12476 |
| 免疫印迹 | 抗GAPDH抗体 | Proteintech | 60004-1-Ig |
| 凋亡检测 | TUNEL试剂盒 | Meilunbio | MA0223 |
| 粒径分析 | Zetasizer Nano ZS90激光粒度仪 | Malvern | -- |
| 体内成像 | 小动物活体生物发光成像系统 | Berthold Technologies | LB |
| 免疫组化 | 链霉亲和素-过氧化物酶试剂盒 | Beijing Zhongshan Jinqiao Biological | -- |
| 统计分析 | GraphPad Prism 8.0软件 | -- | -- |
| 流式数据分析 | FlowJo v10.8.1软件 | FlowJo | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞实验 | MOI值、处理时间、细胞密度、血清浓度、培养条件 阅读提示：Methods: Cell culture, CCK-8, EdU, flow cytometry |
| 动物实验 | 小鼠品系、性别、周龄、接种细胞数量、给药剂量、给药方式、给药时间、分组、样本量、观察时间 阅读提示：Methods: Animal, Orthotopic tumor model, Fig. 5A |
| 病毒制备 | 病毒滴度（PFU/mL）、感染复数、纯化方法、储存条件 阅读提示：Methods: Materials, Preparation and characterization of PD-1/Al@OV |
| 药物释放实验 | H2O2浓度、释放时间点、透析方法、ELISA标准曲线 阅读提示：Methods: Drug release |
| 免疫分析 | 抗体克隆号、稀释比例、染色时间、温度、通道设置、细胞数量 阅读提示：Methods: Flow cytometry analysis of tumor-associated macrophages and T cell, Immunohistochemistry |
