饮食干预与MI模型建立
明确不同BCAA饮食对循环BCAA水平的影响,并建立MI模型以研究对心脏重构的影响。
将雄性及雌性C57BL/6J小鼠分为低、高BCAA饮食组,MI前2周开始喂养,MI后继续喂养4周;通过左冠状动脉永久结扎建立非再灌注MI模型。
Dietary Branched-Chain Amino Acids Modify Postinfarct Cardiac Remodeling and Function in the Murine Heart
包含体外细胞实验(心脏成纤维细胞分化)和体内动物模型(非再灌注心肌梗死小鼠),并进行超声心动图、组织学及分子验证,多层次证据支持结论。
C57BL/6J小鼠非再灌注心肌梗死模型 原代心脏成纤维细胞
饮食干预:低(1/3×)或高(2×)BCAA定制饮食,MI前2周,MI后4周 动物品系与性别:C57BL/6J,雄性和雌性 MI模型:非再灌注MI,左冠状动脉永久结扎 检测时间点:MI前基线,MI后2周和4周 检测指标:超声心动图(每搏输出量、心输出量等)、组织学(心肌细胞长度、毛细血管密度等)
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
明确不同BCAA饮食对循环BCAA水平的影响,并建立MI模型以研究对心脏重构的影响。
将雄性及雌性C57BL/6J小鼠分为低、高BCAA饮食组,MI前2周开始喂养,MI后继续喂养4周;通过左冠状动脉永久结扎建立非再灌注MI模型。
通过超声心动图评估饮食对MI后心脏功能的影响。
在基线、MI后2周和4周进行超声心动图检查,测量心率、心室容积、射血分数、每搏输出量、心输出量等参数。
评估心脏结构重构,包括心肌细胞大小、纤维化和毛细血管密度。
MI后4周取心脏组织,进行组织学染色,包括麦胚凝集素染色测量心肌细胞面积和长度,异凝集素B4染色评估毛细血管密度,天狼星红染色检测胶原纤维。
评估BCAA对心脏肌成纤维细胞分化的直接影响。
分离原代心脏成纤维细胞,在不同浓度BCAA(0、100、400 μM)存在下,用TGF-β处理48小时,通过免疫印迹检测Col1a1、periostin和α-SMA的表达。
检测心脏内BCAA水平及BCAA代谢相关基因表达是否受饮食影响。
通过液相色谱-串联质谱法检测MI后心脏组织中的BCAA浓度,并通过RT-qPCR检测BCAA转运体、分解代谢基因和心力衰竭相关基因的表达。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物模型 | C57BL/6J小鼠 | Jackson Laboratory | -- |
| 饮食干预 | 低BCAA饮食(TD.150662) | Envigo Teklad | TD.150662 |
| 高BCAA饮食(TD.170323) | Envigo Teklad | TD.170323 | |
| 标准饲料(Cat: 5010) | LabDiet | 5010 | |
| 术后镇痛 | 美洛昔康 | -- | -- |
| 超声心动图 | Vevo 3100 | Visual Sonics | -- |
| 组织学染色 | 天狼星红染液 | -- | -- |
| 麦胚凝集素 | Vector Labs | RL-1022 | |
| 异凝集素B4 | Vector Labs | FL-1201 | |
| DAPI | Invitrogen | D3571 | |
| 组织学成像 | 基恩士成像系统 | Keyence | -- |
| 二次谐波成像 | 尼康A1R MP+多光子显微镜 | Nikon | -- |
| 二次谐波成像分析 | MATLAB软件包CurveAlign和CT-FIRE | -- | -- |
| BCAA测量 | BCAA检测试剂盒(ab83374) | Abcam | ab83374 |
| ABSciex 4000 Qtrap串联质谱仪 | Applied Biosystems/MDS Analytical Technologies | -- | |
| 安捷伦1260系列超高效液相色谱系统 | Agilent Technologies | -- | |
| 细胞分离 | II型胶原酶 | Worthington | 46H16739 |
| 细胞培养 | DMEM/F12 GlutaMax培养基 | Gibco | 10565018 |
| 胎牛血清 | VWR | 1500-500H | |
| 青霉素/链霉素/两性霉素B | Sigma | A5955 | |
| 胰岛素转铁蛋白硒(ITS-G) | Gibco | 41400045 | |
| 人碱性成纤维细胞生长因子 | Peprotech | 100-18B | |
| 细胞处理 | 转化生长因子-β | PeproTech | 100-21 |
| L-亮氨酸 | Sigma-Aldrich | L8912 | |
| L-异亮氨酸 | Sigma-Aldrich | I7403 | |
| L-缬氨酸 | Sigma-Aldrich | V0513 | |
| 蛋白提取 | 蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma-Aldrich | P8340 |
| 蛋白印迹 | PVDF膜 | Cytiva | 10600021 |
| Pierce ECL Plus免疫印迹底物 | Thermo Scientific | 32132 | |
| ChemiDoc成像仪 | BioRad | -- | |
| 抗COL1A1抗体 | Thermo Fisher | PA5-29569 | |
| 抗periostin抗体 | Millipore | ABT253 | |
| 抗α-平滑肌肌动蛋白抗体 | Cell Signaling | 19245S | |
| 抗兔IgG HRP偶联抗体 | Cell Signaling | 7074 | |
| RNA提取 | RNeasy Plus Universal Mini试剂盒 | Qiagen | 73404 |
| cDNA合成 | Superscript IV VILO Master Mix(含ezDNase酶) | Thermo Scientific | 11766050 |
| RT-qPCR | SYBR Green荧光染料 | VWR | 101414-278 |
| QuantStudio5 | -- | -- | |
| 统计 | Graphpad Prism 10 | -- | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 实验动物与饮食 | 动物品系:C57BL/6J;性别:雄性和雌性;饮食:低(TD.150662)和高(TD.170323)BCAA定制饮食,以及正常饲料(Cat: 5010);饮食周期:MI前2周,MI后4周;环境:SPF级,24°C,44-65%相对湿度,12小时光照/黑暗循环。 阅读提示:Methods: Experimental Animals and Diets |
| 非再灌注心肌梗死模型 | 小鼠周龄:12周;麻醉:戊巴比妥(50 mg/kg)和氯胺酮(50 mg/kg)腹腔注射;手术:左冠状动脉永久结扎(7-0丝线);镇痛:美洛昔康(10 mg/kg)术前及术后24、48小时。 阅读提示:Methods: Nonreperfused Myocardial Infarction and Echocardiography |
| 超声心动图评估 | 检测点:基线(MI前)、MI后2周和4周;麻醉:异氟烷;测量参数:LV内径、LV质量(校正)、室壁厚度、舒张末期容积、收缩末期容积、每搏输出量、射血分数、心输出量、缩短分数、等容舒张时间;测量次数:M型每次4次,B型5次取平均,脉冲波多普勒9次取平均。 阅读提示:Methods: Echocardiography Analysis |
| 组织学与形态学分析 | 组织处理:心脏在舒张期用2% KCl停跳,切片1mm,10%福尔马林固定,石蜡包埋,4μm切片;染色:PSR(胶原)、WGA(细胞膜)、Isolectin B4(毛细血管)、DAPI(细胞核);成像:Keyence成像系统;分析:Keyence BZ-X800分析器。 阅读提示:Methods: Histopathology |
| 体外成纤维细胞分化实验 | 细胞:原代心脏成纤维细胞(P1);饥饿处理:无BCAA的DMEM/F12 GlutaMax培养基饥饿24小时;刺激:TGF-β(10 ng/mL)处理48小时;BCAA浓度:0、100、200、400 μM(L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸按45.9%缬氨酸、35.3%亮氨酸、18.8%异亮氨酸比例添加);检测:免疫印迹检测Col1a1、periostin、α-SMA。 阅读提示:Methods: Primary Cardiac Fibroblast Isolation and Culture; Figure 5 legend |