跨物种循环进化AAV衣壳文库
通过在不同肾脏模型系统中循环AAV衣壳文库，筛选出具有肾脏趋向性的新AAV变体。
构建AAV9 VR-IV衣壳文库，通过静脉注射在鼠和猪中进化，通过离体感染人类肾脏类器官，并通过离体机器灌注在非人灵长类肾脏中通过动脉和输尿管途径进化。
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通过衣壳文库的跨物种循环进化腺相关病毒以实现肾脏基因转移
Evolving adeno-associated viruses for gene transfer to the kidney via cross-species cycling of capsid libraries
实验完整度
高包含体外细胞模型、人类肾脏类器官、小鼠体内模型、猪和猕猴离体及体内模型多个独立证据层级，并进行功能验证和机制验证。
主要模型
小鼠（C57BL/6J） 猪（Yorkshire） 恒河猴（rhesus macaque） 人类肾脏类器官 TH1细胞（人肾近端小管上皮细胞系）
重点核对
AAV衣壳文库的构建和跨物种循环策略（包括静脉注射、离体机器灌注等） AAV.k13和AAV.k20在多种模型中的转导效率和趋向性 AAV.k13和AAV.k20与AAV9在不同模型中的比较 AAV.k20在非人灵长类中的输尿管递送效果 PD-L1转基因在鼠肾脏中的表达验证
摘要
基因递送至肾脏的困难限制了基因药物的转化，尤其是对于全球超过10%的慢性肾病患者。在这里，我们展示了通过在肾脏模型中跨物种循环衣壳文库，可以获得在小鼠、猪和非人灵长类动物肾脏中显示稳健且广泛转导的腺相关病毒（AAV）新变体。具体而言，新变体AAV.k13和AAV.k20通过在小鼠和猪肾脏中进行顺序静脉循环、在人类类器官培养物中进行离体循环以及恒河猴离体肾脏的离体机器灌注，从文库中富集得到。这两个变体在静脉注射后转导小鼠肾脏，对近端小管具有选择性趋向性，并在人类类器官培养物和自体移植猪肾脏的近端小管上皮细胞中导致比亲本AAV9载体更高的转基因表达。通过输尿管递送，AAV.k20有效转导猪和猕猴的肾脏。AAV.k13和AAV.k20变体是肾脏疾病和移植治疗性基因转移应用的有前景的载体。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否通过跨物种循环衣壳文库获得在肾脏中高效转导的新型AAV变体？
- 核心机制
- 研究揭示AAV.k13和AAV.k20变体在肾脏中对近端小管具有趋向性，可能通过跨细胞转运途径进入近端小管上皮细胞。
- 主要证据
- 在小鼠、猪、猕猴和人类肾脏类器官中，AAV.k13和AAV.k20均比AAV9更高效地转导肾脏，尤其在近端小管上皮细胞中。
- 研究意义
- AAV.k变体为肾脏疾病和移植中的治疗性基因转移提供了有前景的载体。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
人类肾脏类器官转导实验
评估AAV变体（AAV.k13、AAV.k20）在3D人类肾脏类器官中的转导效率和趋向性。
分化人类肾脏类器官（DM1-iPSC来源），在第14天用AAV9、AAV.k13、AAV.k20包装荧光素酶或mCherry报告基因转导，在转导后5天分析。
小鼠体内转导实验
评估AAV变体在小鼠体内静脉注射后的肾脏转导效率和趋向性。
C57BL/6J小鼠（8-10周龄）尾静脉注射AAV9、AAV.k13、AAV.k20包装scCBh-mCherry或ssCBA-luciferase，剂量为5×10^13 vg/kg，4周后收集组织。
猪离体肾脏转导和移植实验
评估AAV变体在猪离体肾脏转导和移植模型中的效果。
猪肾切除后，通过冷保存或机器灌注给予AAV.k13或AAV.k20-scCBh-mCherry，然后自体移植，评估转基因表达。
非人灵长类肾脏转导实验
评估AAV.k20在非人灵长类肾脏中的转导效果，包括离体机器灌注和体内输尿管递送。
猕猴（4-8kg）肾脏离体机器灌注或体内输尿管递送AAV.k20-luciferase，评估转导效果。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| AAV文库构建 | pAAV9-null质粒 | Addgene | 200182 |
| pITR-AAV-Rep2Cap9-GFP质粒 | Addgene | 199744 | |
| AAV载体生产 | HEK293细胞 | -- | -- |
| 类器官培养 | DM1-iPSC细胞系 | NHCDR | EE0000002 |
| 类器官处理 | RNA保存液 | Invitrogen | -- |
| 免疫荧光染色 | 含DAPI的ProLong Gold抗淬灭封片剂 | Invitrogen | -- |
| 莲藕凝集素-FL | Vector Laboratories | FL-1321-2 | |
| 双花扁豆凝集素-FL | Vector Laboratories | FL-1031 | |
| 抗RFP抗体 | Rockland | 600-401-379 | |
| 抗兔Alexa Fluor 594二抗 | Invitrogen | A-11012 | |
| 抗山羊Alexa Fluor 488二抗 | Invitrogen | A-11055 | |
| 抗SGLT1抗体 | Izumi Kaji lab | 576-610 | |
| 抗SGLT2抗体 | Santa Cruz | sc-393350 | |
| 抗mCherry抗体 | Invitrogen | M11217 | |
| 抗nephrin抗体 | R&D Systems | AF3159 | |
| 免疫组织化学 | 抗mCherry抗体 | Novus Biologics | NBP2-25158 |
| 免疫印迹 | 抗Vinculin抗体 | Cell Signaling | 13901 |
| 抗HA标签抗体 | Invitrogen | PA1-985 | |
| 细胞培养 | 高糖DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 荧光素酶检测 | 被动裂解缓冲液 | Promega | -- |
| Halt蛋白酶抑制剂混合物 | ThermoFisher | -- | |
| Varioskan LUX多功能酶标仪 | ThermoFisher | -- | |
| qPCR/RT-qPCR | SYBR Green I 预混液 | Roche Applied Sciences | -- |
| LightCycler 480实时荧光定量PCR仪 | Roche | -- | |
| RT-qPCR | TURBO DNA-free试剂盒 | Invitrogen | -- |
| High-Capacity RNA-to-cDNA试剂盒 | Applied Biosystems | -- | |
| 免疫组化 | Vector TrueView自发荧光淬灭试剂盒 | Vector Laboratories | -- |
| 组织处理 | Tissue-Tek O.C.T包埋剂 | Sakura | -- |
| Leica CM1520冰冻切片机 | Leica | -- | |
| Superfrost Plus显微镜载玻片 | Fisherbrand | -- | |
| 成像 | Echo Revolve显微镜 | Echo | -- |
| Zeiss 880 Airyscan快速倒置共聚焦显微镜 | Zeiss | -- | |
| Bio-Rad ChemiDoc成像系统 | Bio-Rad | -- | |
| 组织处理 | Aperio AT Turbo数字切片扫描仪 | Leica Biosystems | -- |
| Imagescope数字病理软件 | Leica Biosystems | -- | |
| NGS测序 | Ilumina NovaSeq 6000 S-Prime试剂盒 | Illumina | -- |
| PureLink PCR Micro试剂盒 | Invitrogen | -- | |
| Qubit荧光计 | Thermo Fisher | -- | |
| 动物实验 | Fastprep-24组织匀浆机 | MP Biomedicals | -- |
| RIPA裂解液 | ThermoFisher | -- | |
| 免疫印迹 | LDS上样缓冲液 | -- | -- |
| β-巯基乙醇 | -- | -- | |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| 增强化学发光底物 | ThermoFisher | 34049 | |
| 组织固定 | 福尔马林 | VWR | -- |
| 蔗糖 | -- | -- | |
| 免疫荧光 | 牛血清白蛋白 | -- | -- |
| Triton X-100 | -- | -- | |
| 驴血清 | -- | -- | |
| Power Block封闭液 | Biogenex Laboratories | HK0855K |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| AAV衣壳文库构建 | 文库构建方法：基于AAV9 VR-IV区域（氨基酸452-458）的饱和突变；质粒来源（Addgene，200182和199744） 阅读提示：Methods: AAV capsid libraries and recombinant vector production |
| 跨物种循环进化 | 小鼠静脉注射剂量：5×10^13 vg/kg，3天后收集肾脏；猪静脉注射剂量：1×10^13 vg/kg，3周龄猪；人类肾脏类器官转导：1×10^11 vg/孔，24小时后提取DNA；NHP离体灌注：通过动脉或输尿管灌注4小时 阅读提示：Methods: Cycling of AAV capsid libraries in kidney model systems |
| 人类肾脏类器官转导 | 类器官分化方案；转导剂量：1×10^11或1×10^12 vg/孔；载体：scCBh-mCherry或ssCBA-luciferase；转导后5天分析 阅读提示：Methods: iPSC-derived 3D human kidney organoid differentiation and processing 和 Figure 2 legend |
| 小鼠体内转导 | 小鼠品系：C57BL/6J；年龄：8-10周；性别：雄性和雌性；注射途径：尾静脉；剂量：5×10^13 vg/kg；时间：4周；检测：mCherry荧光、luciferase活性、qPCR 阅读提示：Methods: Intravenous administration in wild-type C57/B6 mice 和 Figure 3 和 Figure 4 legend |
| 猪离体肾脏转导和移植 | 猪体重：40-50kg；冷保存或机器灌注时间：2小时；AAV剂量：AAV.k13为5.9×10^12 vg经动脉和5.9×10^12 vg经输尿管；AAV.k20为6.1×10^12 vg经动脉和6.1×10^12 vg经输尿管，或7.5×10^12 vg经输尿管；移植后时间：9-14天 阅读提示：Figure 5 legend 和 Methods: Ex vivo kidney perfusion of AAV vectors in pigs and non-human primates |
| 非人灵长类肾脏转导 | 猕猴体重：4-8kg；体内输尿管递送：通过输尿管递送ssCBA-luciferase，剂量未明确说明；30天后收集；离体灌注：通过动脉或输尿管途径灌注4小时 阅读提示：Methods: In situ delivery of AAV vectors in non-human primate kidneys 和 Ex vivo kidney perfusion of AAV vectors in pigs and non-human primates 和 Figure 4 legend |