建立并培养MLH1敲除人类结肠类器官
获得具有错配修复缺陷、可积累自发突变的体外模型。
使用CRISPR-Cas9敲除MLH1的人类结肠类器官，在含有Wnt3a、R-spondin 1、Noggin、EGF等因子的培养基中长期培养，保持多克隆多样性。
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通过在错配修复缺陷的人类结肠类器官中选择四种自发致癌突变重现腺瘤-癌序列
Recapitulating the adenoma-carcinoma sequence by selection of four spontaneous oncogenic mutations in mismatch-repair-deficient human colon organoids
实验完整度
高包含体外类器官长期培养与选择、全基因组/全外显子组测序、功能验证（Western blot、RT-qPCR、药物敏感性）、体内异种移植实验等多层级证据。
主要模型
人类结肠类器官（MLH1敲除） NSG免疫缺陷小鼠异种移植模型
重点核对
MLH1敲除人类结肠类器官的长期培养（约350-417天） 通过依次去除Wnt3a和R-spondin 1、Noggin、EGF（添加gefitinib或afatinib）以及添加Nutlin-3进行选择 通过全基因组/全外显子组测序确认AXIN1、AXIN2、TP53、ACVR2A、BMPR2、NRAS突变 通过Western blot验证p53、p21、ERK磷酸化 皮下注射200,000个细胞至NSG小鼠，8周后评估肿瘤形成
摘要
致癌作用是由于将正常细胞转化为侵袭性、转移性癌细胞的致癌突变的顺序获取所致。结直肠癌通过其充分描述的腺瘤-癌序列体现了这一过程，此前曾使用成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）诱导野生型人类肠道类器官中的四个连续突变来模拟。在此，我们证明，错配修复缺陷类器官的长期培养允许通过依次去除Wnt激动剂、表皮生长因子（EGF）激动剂和骨形态发生蛋白（BMP）拮抗剂Noggin来选择自发的致癌突变，而TP53突变则通过添加Nutlin-3来选择。因此，类器官依次获得了AXIN1和AXIN2（Wnt通路）、TP53、ACVR2A和BMPR2（BMP通路）以及NRAS（EGF通路）的突变，从而完全独立于干细胞生态位因子。四通路（Wnt、EGF受体、p53和BMP）突变类器官在异种移植后形成实体瘤。这证明，在DNA修复突变背景下，通过靶向四个连续癌症通路的体外选择可以重现致癌作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 在错配修复缺陷背景下，能否仅通过体外生态位因子剥夺选择自发致癌突变，从而重现结直肠癌的腺瘤-癌序列？
- 核心机制
- MLH1缺陷导致的DNA错配修复缺陷促进突变积累，通过依次选择Wnt、BMP、p53和EGF通路的关键基因突变，使类器官逐步获得独立于干细胞生态位因子的能力，最终形成肿瘤。
- 主要证据
- 通过长期培养和依次去除Wnt3a/R-spondin 1、Noggin、EGF（添加抑制剂）及添加Nutlin-3，从单个MLH1敲除类器官中依次分离出AXIN1/2、TP53、ACVR2A/BMPR2、NRAS突变克隆；全基因组/全外显子组测序确认突变，Western blot验证p53、p21、ERK磷酸化，药物敏感性分析和体内异种移植证实肿瘤形成。
- 研究意义
- 该研究表明，仅通过提供四个明确致癌通路的筛选压力，即可从野生型细胞获得完全恶性的癌细胞，为模拟错配修复缺陷相关结直肠癌的肿瘤发生提供了体外模型。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
通过去除Wnt因子选择AXIN1/2突变克隆
筛选获得不受Wnt信号依赖的自发突变克隆。
将MLH1敲除类器官解离成单细胞，在缺少Wnt3a和R-spondin 1的培养基中培养，挑取存活并扩增的克隆进行全基因组测序。
依次选择TP53、BMP通路突变克隆
在Wnt非依赖克隆基础上，进一步筛选获得TP53、BMP通路突变，使类器官逐步独立于更多生态位因子。
将MLH1KO-1−WR克隆分别在缺少Noggin、缺少EGF并加入gefitinib或加入Nutlin-3的培养基中培养，挑取存活克隆进行全外显子组测序。
长期培养选择NRAS突变克隆
通过延长培养时间，积累EGF/Ras通路相关突变，获得四通路突变克隆。
将三通路突变克隆（MLH1KO-1−WR-1+Nu−N-1）长期培养至约300天，然后在缺少EGF并加入afatinib或gefitinib的培养基中选择存活克隆，进行全外显子组测序和功能验证。
体内异种移植验证致瘤性
评估四通路突变类器官在体内的肿瘤形成能力。
将三通路（NRASWT）、四通路（NRASQ61K）、三通路+KRASG12D工程化突变及AKPS突变类器官皮下注射至NSG小鼠，8周后分析肿瘤形成。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 高级DMEM/F12培养基 | Invitrogen | -- |
| B27补充剂 | Invitrogen | -- | |
| 烟酰胺 | Sigma-Aldrich | -- | |
| N-乙酰半胱氨酸 | Sigma-Aldrich | -- | |
| Noggin蛋白 | Peprotech | -- | |
| 重组人EGF | Peprotech | -- | |
| R-spondin 1条件培养基 | Trevigen | -- | |
| Wnt3a条件培养基 | -- | -- | |
| A83-01 | Tocris | -- | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | -- | |
| Cultrex BME基质胶 | Trevigen | -- | |
| TrypLE Express消化液 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Y-27632 | Tocris Bioscience | -- | |
| 药物处理 | Nutlin-3 | Cayman Chemical | -- |
| 吉非替尼 | Selleck Chemicals | -- | |
| 阿法替尼 | Selleck Chemicals | -- | |
| Western blot | cOmplete EDTA-free蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma-Aldrich | -- |
| Bradford蛋白定量试剂盒 | Bio-Rad | -- | |
| 抗p53抗体（DO-1） | Santa Cruz Biotechnology | sc-126 | |
| 抗p21抗体（F-5） | Santa Cruz Biotechnology | sc-6246 | |
| 抗GAPDH抗体（ab9485） | Abcam | -- | |
| 抗磷酸化p44/42 MAPK抗体（CST9101） | Cell Signaling Technology | -- | |
| 抗β-actin抗体（13E5） | Cell Signaling Technology | -- | |
| SuperSignal West Femto最大灵敏度底物 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| RT-qPCR | RNeasy micro RNA提取试剂盒 | QIAGEN | -- |
| GoScript逆转录酶 | Promega | -- | |
| IQ SYBR green预混液 | Bio-Rad | -- | |
| DNA提取 | Quick-DNA小量提取试剂盒 | Zymo Research | D3024 |
| 全外显子组测序 | Agilent SureSelect V7全外显子组捕获试剂盒 | Agilent | -- |
| NovaSeq测序平台 | Illumina | -- | |
| 基因编辑 | SpCas9-eGFP载体 | Addgene | 48138 |
| NEPA21超级电穿孔仪 | NEPA GENE | -- | |
| Q5高保真DNA聚合酶 | New England Biolabs | -- | |
| Zymogen Quick-DNA微量提取试剂盒 | Zymo Research | -- | |
| 药物筛选 | Cell Titer Glo细胞活力检测试剂 | Promega | -- |
| HP D300e数字分配器 | Hewlett-Packard | -- | |
| SPARK发光检测仪 | Tecan | -- | |
| 组织学 | 抗E-cadherin抗体（克隆36） | BD Biosciences | 610182 |
| 抗Ki67抗体（克隆MM1） | BD Pharmingen | 550609 | |
| 抗β-catenin抗体（H-102） | Santa Cruz Biotechnology | sc-7199 | |
| 抗EGFR抗体（克隆EP38Y） | Abcam | ab52894 | |
| 动物实验 | NSG小鼠（NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ） | The Jackson Laboratory | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与建立 | MLH1敲除人类结肠类器官的建立方法和来源 阅读提示：Methods: Organoid culture establishment |
| 选择培养基成分 | 选择培养基中去除/添加的因子及其浓度（如Wnt3a、R-spondin 1、Noggin、EGF、Nutlin-3、gefitinib、afatinib） 阅读提示：Methods: Organoid selection |
| 选择实验操作 | 单细胞接种密度、培养时间、挑取存活克隆的标准 阅读提示：Methods: Organoid selection |
| 突变鉴定 | 全基因组/全外显子组测序的比对和变异过滤参数 阅读提示：Methods: WGS and WES, Mutation calling and filtering |
| 体内移植 | 注射细胞数、小鼠品系、观察时间 阅读提示：Methods: In vivo subcutaneous transplantation |