样本收集与临床数据采集
获取不同来源的脑血栓样本并记录临床特征,以进行后续微生物分析。
连续纳入40例接受血管内取栓术的急性缺血性卒中患者,收集脑血栓样本(分为大动脉粥样硬化组15例,心源性栓塞组25例),记录基线临床数据、实验室检查指标、NIHSS评分、mRS评分等。
Microbial Heterogeneity Identification of Cerebral Thrombi Via Metagenomic Next-Generation Sequencing-Based Strategy
研究包含患者样本的宏基因组测序、生物信息学分析、统计比较及预测模型构建,但缺乏体外或动物模型等独立实验验证。
急性缺血性卒中患者脑血栓样本 大动脉粥样硬化血栓(n=15) 心源性栓塞血栓(n=25)
脑血栓样本来源:急性缺血性卒中患者,经血管内取栓术获取 样本分组:基于TOAST标准分为大动脉粥样硬化组(15例)和心源性栓塞组(25例) 测序方法:宏基因组下一代测序,使用Illumina NextSeq 550平台,75bp单端测序,Q30≥90%,每样本至少1500万读数 生物信息分析:去除人类宿主序列后,与病原体数据库比对,使用IDseq软件确定微生物丰度 菌群差异分析:采用Wilcoxon秩和检验和LEfSe分析,LDA评分阈值>2判定差异物种
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
获取不同来源的脑血栓样本并记录临床特征,以进行后续微生物分析。
连续纳入40例接受血管内取栓术的急性缺血性卒中患者,收集脑血栓样本(分为大动脉粥样硬化组15例,心源性栓塞组25例),记录基线临床数据、实验室检查指标、NIHSS评分、mRS评分等。
提取血栓样本中的微生物DNA并进行高通量测序,以获得微生物组成和基因组信息。
将血栓组织剪碎并破壁,使用TIANamp Micro DNA Kit提取核酸,片段化后构建文库,在Illumina NextSeq 550上进行75bp单端测序,并进行质量控制以排除环境污染物。
比较不同来源血栓的微生物群落组成和多样性,寻找差异分类群。
使用IDseq软件分析测序数据,去除宿主序列后比对微生物数据库,计算菌群相对丰度。采用α多样性指数(Shannon、Chao等)和β多样性分析(PCoA、PCA)评估多样性差异,进行层级聚类和Wilcoxon秩和检验比较两组间物种丰度,并用LEfSe分析识别差异物种。
基于微生物基因标志物构建预测模型,以区分大动脉粥样硬化血栓和心源性栓塞血栓的来源。
使用R包randomForest构建随机森林分类器,基于两组间丰度差异的核心属/种作为输入变量,通过嵌套10折交叉验证选择特征,最终获得9个OTU的最优标记集,并用ROC曲线评估模型效能。
探索血栓微生物组与患者临床指标之间的关联,以评估微生物对宿主功能的影响。
利用Spearman相关分析,计算20个OTU与11个临床指标(如NIHSS、mRS、中性粒细胞计数等)之间的相关性,并可视化热图。
分析血栓微生物的基因功能,揭示其参与的生物过程和代谢通路。
对宏基因组数据进行基因注释,使用GO和KEGG富集分析,比较两组间差异表达基因的富集功能。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 核酸提取 | TIANamp微量DNA提取试剂盒 | TIANGEN | DP316 |
| 测序平台 | Illumina NextSeq 550测序仪 | Illumina | -- |
| 统计分析 | IBM SPSS Statistics 22统计软件 | IBM | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 样本收集 | 纳入患者为急性缺血性卒中并接受血管内取栓术;分为大动脉粥样硬化组(n=15)和心源性栓塞组(n=25);纳入标准年龄>18岁;排除标准包括当前感染、自身免疫病、严重肝肾功能损害、活动性或复发性癌症。 阅读提示:Methods: Study Patients and Sample Preparation |
| 测序流程 | 核酸提取使用TIANamp Micro DNA Kit;破壁条件:0.5mm玻璃珠1g,0.6mL样本,2800-3200r/min振荡30分钟;DNA片段化至200-300bp;测序平台Illumina NextSeq 550;75bp单端测序;Q30≥90%;每样本≥15百万读数。 阅读提示:Methods: Nucleic Acid Extraction, Library Preparation, and Sequencing |
| 生物信息分析 | 去除宿主序列;使用IDseq软件;病原体数据库包括6350种细菌、1064种真菌、4945种病毒、234种寄生虫。 阅读提示:Methods: Bioinformatics Analyses |
| 菌群多样性分析 | α多样性指数(Shannon、Chao、ACE等)和β多样性分析(PCoA、PCA)用于比较两组间差异;统计检验使用Wilcoxon秩和检验和LEfSe分析(LDA评分>2)。 阅读提示:Methods: Bacterial Diversity and Taxonomic Analysis |
| 预测模型构建 | 随机森林模型构建基于OTU重要性排序;使用10折交叉验证;最终选择9个OTU作为标记;模型评估使用AUC(0.903)和ROC曲线。 阅读提示:Methods: Random Forest Model Prediction |