基于宏基因组下一代测序策略的脑血栓微生物异质性鉴定

Microbial Heterogeneity Identification of Cerebral Thrombi Via Metagenomic Next-Generation Sequencing-Based Strategy

作者信息Xi Chen, Yuxuan He, Linke Zhou, Xingtong Li, Meiling Jiang, Min Wu, Jing Li, Li Chen, Huan Xu, Li Gui, Zhenhua Zhou
PMID39248272
发布时间2024-09-17
DOI10.1161/JAHA.123.033221

实验完整度

研究包含患者样本的宏基因组测序、生物信息学分析、统计比较及预测模型构建,但缺乏体外或动物模型等独立实验验证。

主要模型

急性缺血性卒中患者脑血栓样本 大动脉粥样硬化血栓(n=15) 心源性栓塞血栓(n=25)

重点核对

脑血栓样本来源:急性缺血性卒中患者,经血管内取栓术获取 样本分组:基于TOAST标准分为大动脉粥样硬化组(15例)和心源性栓塞组(25例) 测序方法:宏基因组下一代测序,使用Illumina NextSeq 550平台,75bp单端测序,Q30≥90%,每样本至少1500万读数 生物信息分析:去除人类宿主序列后,与病原体数据库比对,使用IDseq软件确定微生物丰度 菌群差异分析:采用Wilcoxon秩和检验和LEfSe分析,LDA评分阈值>2判定差异物种

摘要

背景:脑血栓病因的诊断对于预防复发至关重要,但也具有挑战性。近期已证实血栓中存在微生物组,提示了一种区分不同来源脑血栓的新方法。然而,关于不同来源脑血栓的微生物定植是否存在异质性,目前知之甚少。方法和结果:本研究纳入40例急性缺血性卒中患者,并收集临床数据。采用宏基因组下一代测序检测人脑血栓样本的细菌和基因组特征。我们发现,大动脉粥样硬化血栓和心源性栓塞血栓之间的物种多样性相似,但脑血栓微生物群的物种组成和分布不同。与心源性栓塞组相比,大动脉粥样硬化组脑血栓中排名前10的细菌物种中Ralstonia insidiosa的相对丰度显著更高。20个操作分类单元与缺血性卒中的11项临床指标相关。基因本体富集分析揭示了9个不同的富集生物过程(如翻译和碳水化合物代谢过程等)。富集的京都基因与基因组百科全书通路包括核糖体、丁酸代谢和硫代谢。结论:本研究基于宏基因组下一代测序方法,提供了一种利用人脑血栓样本鉴别心源性栓塞血栓与大动脉粥样硬化血栓的诊断微生物学方法。我们的发现为脑血栓的微生物异质性提供了新视角,并展示了脑血栓的生物过程和通路特征。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
不同来源(大动脉粥样硬化与心源性栓塞)的脑血栓在微生物定植上是否存在异质性,能否基于此鉴别血栓来源。
核心机制
大动脉粥样硬化血栓中的Ralstonia insidiosa相对丰度显著升高,可能与该菌释放的脂多糖参与神经炎症和动脉粥样硬化有关。
主要证据
通过对40例脑血栓样本的宏基因组测序,发现大动脉粥样硬化组中Ralstonia insidiosa丰度显著高于心源性栓塞组,并利用随机森林模型构建了基于9个OTU的诊断模型(AUC=0.903),且多菌种与临床指标显著相关。
研究意义
提供了基于宏基因组测序的诊断微生物学方法,以区分动脉粥样硬化性血栓和心源性血栓,并为开发溶栓和血栓预防的宏基因组测序治疗策略提供了新方向。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

样本收集与临床数据采集

获取不同来源的脑血栓样本并记录临床特征,以进行后续微生物分析。

连续纳入40例接受血管内取栓术的急性缺血性卒中患者,收集脑血栓样本(分为大动脉粥样硬化组15例,心源性栓塞组25例),记录基线临床数据、实验室检查指标、NIHSS评分、mRS评分等。

2

核酸提取、文库构建与测序

提取血栓样本中的微生物DNA并进行高通量测序,以获得微生物组成和基因组信息。

将血栓组织剪碎并破壁,使用TIANamp Micro DNA Kit提取核酸,片段化后构建文库,在Illumina NextSeq 550上进行75bp单端测序,并进行质量控制以排除环境污染物。

3

微生物组成与多样性分析

比较不同来源血栓的微生物群落组成和多样性,寻找差异分类群。

使用IDseq软件分析测序数据,去除宿主序列后比对微生物数据库,计算菌群相对丰度。采用α多样性指数(Shannon、Chao等)和β多样性分析(PCoA、PCA)评估多样性差异,进行层级聚类和Wilcoxon秩和检验比较两组间物种丰度,并用LEfSe分析识别差异物种。

4

诊断模型构建

基于微生物基因标志物构建预测模型,以区分大动脉粥样硬化血栓和心源性栓塞血栓的来源。

使用R包randomForest构建随机森林分类器,基于两组间丰度差异的核心属/种作为输入变量,通过嵌套10折交叉验证选择特征,最终获得9个OTU的最优标记集,并用ROC曲线评估模型效能。

5

临床相关性分析

探索血栓微生物组与患者临床指标之间的关联,以评估微生物对宿主功能的影响。

利用Spearman相关分析,计算20个OTU与11个临床指标(如NIHSS、mRS、中性粒细胞计数等)之间的相关性,并可视化热图。

6

功能富集分析

分析血栓微生物的基因功能,揭示其参与的生物过程和代谢通路。

对宏基因组数据进行基因注释,使用GO和KEGG富集分析,比较两组间差异表达基因的富集功能。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
TIANamp微量DNA提取试剂盒TIANGENDP316
Illumina NextSeq 550测序仪Illumina--
IBM SPSS Statistics 22统计软件IBM--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
样本收集
纳入患者为急性缺血性卒中并接受血管内取栓术;分为大动脉粥样硬化组(n=15)和心源性栓塞组(n=25);纳入标准年龄>18岁;排除标准包括当前感染、自身免疫病、严重肝肾功能损害、活动性或复发性癌症。
阅读提示:Methods: Study Patients and Sample Preparation
测序流程
核酸提取使用TIANamp Micro DNA Kit;破壁条件:0.5mm玻璃珠1g,0.6mL样本,2800-3200r/min振荡30分钟;DNA片段化至200-300bp;测序平台Illumina NextSeq 550;75bp单端测序;Q30≥90%;每样本≥15百万读数。
阅读提示:Methods: Nucleic Acid Extraction, Library Preparation, and Sequencing
生物信息分析
去除宿主序列;使用IDseq软件;病原体数据库包括6350种细菌、1064种真菌、4945种病毒、234种寄生虫。
阅读提示:Methods: Bioinformatics Analyses
菌群多样性分析
α多样性指数(Shannon、Chao、ACE等)和β多样性分析(PCoA、PCA)用于比较两组间差异;统计检验使用Wilcoxon秩和检验和LEfSe分析(LDA评分>2)。
阅读提示:Methods: Bacterial Diversity and Taxonomic Analysis
预测模型构建
随机森林模型构建基于OTU重要性排序;使用10折交叉验证;最终选择9个OTU作为标记;模型评估使用AUC(0.903)和ROC曲线。
阅读提示:Methods: Random Forest Model Prediction