构建工程化心脏组织模型
建立具有成熟心肌特征的体外模型，以模拟心肌应激和自身抗体结合环境。
将hiPSC-CMs和原代心脏成纤维细胞以3:1比例混合于纤维蛋白水凝胶中，在milliPillar平台上进行电机械刺激，培养于成熟培养基中。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
一种工程化人类心脏组织模型揭示系统性红斑狼疮自身抗体对心肌损伤的贡献
An engineered human cardiac tissue model reveals contributions of systemic lupus erythematosus autoantibodies to myocardial injury
实验完整度
高包含临床队列、工程化心脏组织、细胞培养、功能测定、RNA-seq、PhIP-seq、表面蛋白组学等多个独立证据层级，且包含功能验证和机制验证。
主要模型
工程化人类心脏组织（hiPSC-CMs与心脏成纤维细胞共培养） hiPSC-CMs（WTC11-GCaMP6f） 原代人心脏成纤维细胞（NHCF-V） SLE患者队列（分为Myo-、Myo+SD-、Myo+SD+）
重点核对
患者IgG浓度：0.5 μg/ml 电刺激频率递增方案：2 Hz至6 Hz，持续14天 培养时间：IgG处理14天 分组：Myo-（n=3）、Myo+SD-（n=4）、Myo+SD+（n=4）、健康对照（n=3） 钙处理测定：tau和FWHM，与基线比较
摘要
系统性红斑狼疮（SLE）是一种异质性自身免疫性疾病，影响包括心脏在内的多个器官。SLE中心肌损伤的机制仍知之甚少。在本研究中，我们工程化人类心脏组织，并将其与SLE患者的IgG共培养，这些患者有或没有心肌受累。来自心肌炎症升高的患者的IgG与心脏组织在应激条件下凋亡细胞的结合增加，而来自收缩功能障碍患者的IgG与活心肌细胞表面的结合增强。功能测定和RNA测序显示，在没有免疫细胞的情况下，来自收缩功能障碍患者的IgG改变了细胞组成、呼吸和钙处理。噬菌体免疫沉淀测序（PhIP-seq）证实了患者亚组之间不同的IgG谱。将IgG谱分析与细胞表面组分析相结合，确定了四种可能直接影响心肌的潜在致病性自身抗体。总体而言，这些见解可能改善患者风险分层，并为开发新的治疗策略提供信息。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- SLE患者自身抗体是否以及如何直接导致心肌损伤，以及不同临床表型是否与独特的自身抗体特征相关。
- 核心机制
- Myo+SD+患者的IgG与活心肌细胞表面结合，通过影响线粒体功能（降低线粒体质量、呼吸和呼吸效率，增加SDH活性）和钙处理（延长tau和FWHM），直接改变心脏组织功能，不依赖补体和免疫细胞。
- 主要证据
- 工程化心脏组织与患者IgG共培养后，Myo+SD+ IgG导致钙处理异常、转录组改变、线粒体功能障碍；PhIP-seq和细胞表面组分析鉴定出四个潜在致病性自身抗体靶点（DIP2A、LMO7、PVR、PLAUR）。
- 研究意义
- 该模型有助于改善SLE患者心肌受累的风险分层，并可能为识别新的治疗靶点提供依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
患者IgG处理及结合检测
评估不同临床亚组患者IgG与心脏组织的结合模式。
在培养第14天加入患者纯化IgG（0.5 μg/ml），继续培养14天；通过免疫荧光染色定量IgG结合水平（MFI），并分析结合模式。
评估IgG对心脏组织功能的影响
检测患者IgG是否直接影响心脏组织的钙处理和收缩功能。
在IgG处理前（基线）和处理后第7天和第14天，测量组织钙瞬变（tau、FWHM）和收缩力。
转录组分析
确定Myo+SD+ IgG处理对组织转录谱的影响。
对处理后的组织进行RNA-seq，分析差异表达基因，并进行KEGG、GO通路分析和CIBERSORTx细胞组分预测。
线粒体功能评估
验证Myo+SD+ IgG对心肌细胞线粒体功能的影响。
使用MitoTracker Green测定线粒体质量，Seahorse测定氧气消耗率，并测量SDH活性和线粒体膜电位（TMRM）。
鉴定自身抗体靶点
识别Myo+SD+患者特异性的潜在致病性自身抗体及其靶点。
通过PhIP-seq分析患者IgG反应谱，结合心肌细胞和成纤维细胞表面蛋白组学，筛选与心肌损伤相关的候选靶点。
评估IgG对成纤维细胞增殖的影响
探究患者IgG是否促进心脏成纤维细胞增殖。
用患者IgG处理心脏成纤维细胞单层72小时，通过Ki-67染色定量增殖细胞比例。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| IgG纯化 | NAb Protein A/G离心试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 89950 |
| Zeba离心脱盐柱 | Thermo Fisher Scientific | 87766 | |
| 细胞培养 | mTeSR Plus培养基 | STEMCELL Technologies | 100-0276 |
| Matrigel基质胶 | Corning | 354230 | |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575 | |
| 细胞分化 | RPMI 1640培养基 | Thermo Fisher Scientific | A4192302 |
| 重组人白蛋白 | Sigma-Aldrich | A9731 | |
| L-抗坏血酸2-磷酸 | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| CHIR99021 | Tocris Bioscience | 4423 | |
| Wnt-C59 | Tocris Bioscience | 5148 | |
| II型胶原酶 | Worthington | LS004176 | |
| 胰酶 | Sigma-Aldrich | P7545 | |
| 细胞培养 | 成纤维细胞生长培养基3 | PromoCell | C-23130 |
| 外周血单个核细胞 | STEMCELL Technologies | 70025.2 | |
| 组织工程 | 聚二甲基硅氧烷 | Dow Chemical Company | 02065622 |
| 人纤维蛋白原 | Sigma-Aldrich | F3879 | |
| 人凝血酶 | Sigma-Aldrich | T6884 | |
| 6-氨基己酸 | Sigma-Aldrich | A7824 | |
| 免疫染色 | 抗人IgG二抗 | Thermo Fisher Scientific | A21090 |
| 抗α-肌动蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | A7811 | |
| 抗波形蛋白抗体 | Abcam | ab24525 | |
| NucBlue核染料 | Thermo Fisher Scientific | R37606 | |
| ProLong Diamond抗淬灭封片剂 | Invitrogen | 36961 | |
| 流式细胞术 | CF-647标记抗人IgG | Sigma-Aldrich | SAB4600181 |
| Apotracker Green凋亡检测试剂 | BioLegend | 427401 | |
| 碘化丙啶 | Thermo Fisher Scientific | R37169 | |
| 成像 | 激光共聚焦显微镜 | Nikon Instruments | -- |
| 高内涵成像系统 | BioTek Cytation 5, Agilent | -- | |
| 钙成像 | sCMOS相机 | Andor Technology | -- |
| 线粒体功能 | MitoTracker Green线粒体染料 | Thermo Fisher Scientific | M46750 |
| TMRM膜电位荧光探针 | -- | -- | |
| XF细胞线粒体应激测试试剂盒 | Agilent | 103015-100 | |
| SDH活性检测试剂盒 | Abcam | ab228560 | |
| RNA提取 | RNeasy微量试剂盒 | Qiagen | 74004 |
| RNA-seq | SMART-Seq v4超低起始量RNA试剂盒 | TaKaRa | -- |
| Nextera XT DNA文库制备试剂盒 | Illumina | -- | |
| 表面蛋白分析 | Pierce细胞表面生物素化与分离试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | A44390 |
| Halt蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物 | Thermo Fisher Scientific | 78442 | |
| PhIP-seq | Q5热启动聚合酶 | New England Biolabs | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 患者队列 | 患者分组标准：18F-FDG PET/CT SUVmax≥1.5定义为心肌炎症；EF<50%定义为收缩功能障碍；样本量：Myo-（n=3）、Myo+SD-（n=4）、Myo+SD+（n=4）、健康对照（n=3）。 阅读提示：Methods部分'Patient cohort'和'18F-FDG PET/CT' |
| 工程化心脏组织制备 | hiPSC-CMs与成纤维细胞比例3:1；细胞浓度37,000 cells/μl；纤维蛋白原浓度5 mg/ml；培养于成熟培养基（MM）；电刺激方案：2 Hz至6 Hz递增，持续14天。 阅读提示：Methods部分'Human engineered cardiac tissues'和'Optimization of engineered cardiac tissue culture medium' |
| IgG处理 | IgG浓度0.5 μg/ml；处理时间14天；添加时机为电刺激开始后7天（频率达到4 Hz时）。 阅读提示：Methods部分'Engineered cardiac tissue incubation with autoantibodies' |
| 钙处理测定 | 测量时间点为基线（第14天）和第21、28天；数据归一化至基线；参数：tau（τ）、FWHM、钙瞬变幅度等。 阅读提示：Methods部分'Calcium imaging and analysis' |
| 线粒体功能测定 | MitoTracker Green浓度及孵育时间；Seahorse检测中寡霉素、FCCP、鱼藤酮/抗霉素A的终浓度（1.5 μM、0.5 μM、0.5 μM）；TMRM浓度（20 nM）及孵育时间（30分钟）。 阅读提示：Methods部分'MitoTracker Green assay'、'Measurement of mitochondrial membrane potential'和'Metabolic analysis' |