候选脱氨酶的鉴定与结构聚类
基于序列同源性和三维结构相似性，从数据库中发现并分类胞苷脱氨酶。
使用APOBEC样脱氨酶结构域（PF08210和PF05240）对UniProt数据库进行同源搜索，筛选出1,483条序列。利用AlphaFold2预测其三维结构，并通过TM-score进行两两比对，采用分区聚类方法将其分为184个簇。从每个簇中随机选取10%（至少一个）代表序列，共272个候选脱氨酶。
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基于结构引导发现具有序列背景独立性的高效应胞苷脱氨酶
Structure-guided discovery of highly efficient cytidine deaminases with sequence-context independence
实验完整度
高研究包含结构预测与聚类分析、高通量编辑活性筛选、R-loop脱靶检测、内源位点编辑、多种Cas蛋白兼容性及多基因敲除验证等多个独立证据层级，并进行了功能与机制验证。
主要模型
HEK293T细胞（sgRNA靶标文库稳转系） 小鼠N2A细胞 小鼠胚胎干细胞（mESCs） 猪肾PK-15细胞 人肝癌HepG2细胞
重点核对
胞苷脱氨酶序列选自UniProt数据库，e-value <0.01，且以APOBEC样N端（PF08210）或C端（PF05240）结构域为查询 结合于sgRNA靶标文库的HEK293T细胞，经慢病毒转导，MOI=0.3，并用FACS或嘌呤霉素筛选稳定表达 使用102 sgRNA靶标文库进行初始筛选，转染6μg CBE质粒于1×10^6细胞（6孔板），120小时后收集 使用11,868 sgRNA靶标文库进行深入表征，转染40μg CBE质粒于6×10^6细胞（10-cm皿），72小时后FACS分选 R-loop脱靶检测使用HEK293T细胞，共转染0.75μg dSaCas9-sgRNA和0.75μg CBE质粒（24孔板），5天后收集 CD0208P52A在N2A细胞中表现出较高的编辑效率（41.2%）和终止密码子引入效率（25.0%），优于rAPOBEC1、YE1、eA3A等 CD0208P52A在mESC和PK-15细胞中能高效编辑多拷贝基因（Rbmy1a1, Ssty1, Ssty2, PERV pol），平均效率显著高于对照 CD0208P52A与nSaCas9、nSpCas9-NG及dCpf1融合均显示高效编辑，且dCpf1融合显著降低非C-to-T替换和indel
摘要
胞嘧啶碱基编辑器的适用性受到其对序列背景的依赖和脱靶效应的阻碍。在此，我们通过使用AlphaFold2预测1,483种胞苷脱氨酶的三维结构，并通过实验表征代表性脱氨酶（在通过分区聚类分类后从每个结构簇中选取），报告发现了一些具有高编辑效率、多样化编辑窗口和增加的目标对脱靶效应比率的脱氨酶。具体来说，几种脱氨酶在AC/TC/CC/GC位点诱导了相当效率的C到T转换，这些脱氨酶能够在哺乳动物细胞中不需双链断裂即可在单拷贝和多拷贝基因中引入终止密码子，并且预测的DNA相互作用位点的一些残基转换减少了脱靶效应。基于结构的生成式机器学习可进一步用于扩展碱基编辑器在基因治疗中的适用性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何发现具有高编辑效率、低脱靶效应且不依赖序列背景的新型胞苷脱氨酶，以改进胞嘧啶碱基编辑器的性能？
- 核心机制
- 研究中未明确提出具体的分子机制，但CD0208的P52残基被预测为与ssDNA结合相关，其突变（P52A）可显著降低脱靶效应而不影响编辑效率，表明靶向DNA结合界面的理性突变可改善编辑特异性。
- 主要证据
- 通过AlphaFold2结构预测和聚类筛选出候选脱氨酶；在多种细胞系和多个位点验证了CD0208及其P52A变体的高编辑效率、序列背景非依赖性和低脱靶效应；在mESCs和PK-15细胞中成功编辑多拷贝基因，且未引起DSB介导的细胞凋亡。
- 研究意义
- 研究证明了基于AI的结构导向方法在功能蛋白挖掘中的潜力，并提供了具有高效率和低脱靶效应的新型胞苷脱氨酶，可推动碱基编辑器在基因治疗等应用中的发展。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
候选脱氨酶编辑活性筛选
评估候选脱氨酶在CBE中的C-to-T编辑效率和脱靶效应。
将272个候选脱氨酶构建到CBE表达载体中，转染到稳定表达sgRNA靶标文库（102个或11,868个位点）的HEK293T细胞中，通过高通量测序分析编辑效率。同时使用正交R-loop实验检测非sgRNA依赖性脱靶效应。
内源位点编辑验证
在基因组内源靶位点验证高效应CD0208的编辑效率和序列背景偏好性。
在HEK293T细胞中，将CD0208 CBE与靶向34个内源位点的sgRNA共转染，通过高通量测序分析C-to-T编辑效率及不同序列背景（AC/TC/GC/CC）下的编辑活性。
CD0208的理性突变和脱靶效应降低
通过丙氨酸扫描突变预测的DNA相互作用残基，筛选出降低脱靶效应且保持高编辑活性的变体。
使用DRNApred预测CD0208中27个参与ssDNA结合的氨基酸残基，并分别突变为丙氨酸。在稳定表达11,868 sgRNA文库的HEK293T细胞中检测突变体的编辑效率和R-loop脱靶效应。
CD0208P52A CBE在基因敲除中的应用
验证CD0208P52A CBE能否在单拷贝和多拷贝基因中高效引入无义突变。
在小鼠N2A细胞中，针对Tyr基因设计11个sgRNA，评估CD0208P52A CBE引入终止密码子或剪接位点突变的效率。在mESC中针对Y染色体多拷贝基因（Rbmy1a1, Ssty1, Ssty2）设计sgRNA，评估编辑效率。在PK-15细胞中针对PERV pol基因设计sgRNA，评估引入无义突变的效率。
CD0208P52A与多种Cas蛋白的兼容性
测试CD0208P52A是否能与不同Cas蛋白融合并保持编辑活性。
构建了CD0208P52A与nSaCas9（D10A）、nSpCas9-NG和dCpf1的融合CBE。在HEK293T细胞中，将CBE与相应的sgRNA共转染，评估C-to-T编辑效率、编辑窗口、碱基替换模式和indel频率。
在致病基因编辑中的应用
评估CD0208P52A CBE在致病基因（如Pcsk9）中的编辑效率及功能影响。
在小鼠N2A细胞中，针对Hpd和Pcsk9基因设计sgRNA，评估CD0208P52A-nSpCas9的编辑效率。在人HepG2细胞中，针对PCSK9基因设计sgRNA，评估编辑效率及对DiI-LDL摄取的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
结构预测与聚类分析
脱靶效应评估
基因表达分析
功能验证
生物信息学分析
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 杜氏改良Eagle培养基 | Yeasen | 41401ES76 |
| 胎牛血清 | Biological Industries | 04-001-1ACS | |
| 青霉素-链霉素 | Beyotime | C0224-100ml | |
| 杜氏改良Eagle培养基 | Millipore | SLM-220-B | |
| 胎牛血清 | Gibco | 10099141 | |
| 最低必需培养基非必需氨基酸溶液 | Millipore | TMS-001-C | |
| GlutaMAX补充剂 | Thermo Fisher | 35050061 | |
| 核苷 | Millipore | ES-008-D | |
| β-巯基乙醇 | Millipore | ES-007-E | |
| PD0325901 | Selleck | S1036 | |
| CHIR99021 | Selleck | S1263 | |
| 小鼠白血病抑制因子 | Millipore | ESG1107 | |
| 慢病毒包装和转导 | 聚乙烯亚胺 | Polysciences | 24765-1 |
| 细胞培养 | 嘌呤霉素 | Invivogen | ant-pr-1 |
| 细胞转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | L3000015 |
| Lonza Nucleofector 2b设备 | Lonza | -- | |
| 基因组DNA提取 | 基因组DNA提取试剂盒 | Tiangen | DP304-03 |
| PCR扩增 | Takara Ex Taq聚合酶 | Takara | RR902A |
| PCR产物纯化 | 通用DNA纯化试剂盒 | Tiangen | DP219 |
| RNA提取与qPCR | RNA-easy分离试剂 | Vazyme | R701-02 |
| HiScript ll Q RT SuperMix qPCR试剂盒 | Vazyme | R223-01 | |
| AceQ通用SYBR qPCR预混液 | Vazyme | Q511-02 | |
| CFXOplus96系统 | Bio-Rad | -- | |
| DiI-LDL摄取实验 | DiI-LDL荧光探针 | Yiyuan Biotechnologies | YB-0011 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 候选脱氨酶筛选 | 同源序列筛选使用Pfam数据库的PF08210和PF05240结构域，e值<0.01，且序列以甲硫氨酸起始并以终止密码子结尾 阅读提示：Methods: Identification and 3D structure-based clustering of candidate cytidine deaminases |
| 结构聚类 | 使用AlphaFold2预测结构，TM-score>0.7作为分区聚类的阈值，并按长度降序排列选择初始聚类中心 阅读提示：Methods: Identification and 3D structure-based clustering of candidate cytidine deaminases; Supplementary Methods |
| 编辑活性筛选 | 使用102 sgRNA靶标文库的HEK293T稳转细胞系，转染6μg CBE质粒于1×10^6细胞（6孔板），120小时后收集；使用11,868 sgRNA文库的细胞系，转染40μg CBE质粒于6×10^6细胞（10-cm皿），72小时后FACS分选 阅读提示：Methods: Cell transfection; Figure 2 legend |
| 脱靶效应检测 | 使用正交R-loop实验，在HEK293T细胞中共转染0.75μg dSaCas9-sgRNA和0.75μg CBE质粒（24孔板），5天后收集；检测位点为Sa site3, Sa site4, Sa site5, Sa site6 阅读提示：Methods: Orthogonal R-loop assays; Extended Data Fig. 3 |
| 单拷贝基因编辑（N2A细胞） | N2A细胞数量为2×10^5（24孔板），转染0.75μg sgRNA和0.75μg CBE质粒，72小时后FACS收集 阅读提示：Methods: Cell transfection; Figure 4 legend |
| 多拷贝基因编辑（mESCs和PK-15细胞） | mESCs转染0.25μg sgRNA和0.25μg CBE质粒，使用Lipofectamine 3000；PK-15细胞转染3μg sgRNA和3μg CBE质粒，使用Lonza Nucleofector 2b（T-020程序）；均72小时后FACS收集 阅读提示：Methods: Cell transfection; Figure 4 legend |
| 多Cas蛋白兼容性 | 分别将CD0208P52A与nSaCas9（D10A）、nSpCas9-NG和dCpf1融合，在HEK293T细胞中检测编辑效率；针对nSaCas9测试7个靶点，nSpCas9-NG测试8个靶点，dCpf1测试13个靶点 阅读提示：Methods: Plasmid construction; Figure 5 legend |
| 致病基因编辑 | N2A细胞中针对Hpd和Pcsk9基因设计sgRNA；HepG2细胞中针对PCSK9设计sgRNA，并使用20 μg/ml DiI-LDL孵育4小时 阅读提示：Methods: Cell transfection; Figure 6 legend |