患者队列遗传分析与STR突变鉴定
确定导致显性遗传性RTSH的因果基因变异。
对101个RTSH家系进行WGS和Sanger测序，鉴定出12个家系携带STR突变（4/3或4/4*），并与表型共分离。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
染色体15q上的STR突变通过激活MIR7-2/MIR1179的灵长类特异性增强子导致促甲状腺激素抵抗
STR mutations on chromosome 15q cause thyrotropin resistance by activating a primate-specific enhancer of MIR7-2/MIR1179
实验完整度
高包含患者队列遗传分析、甲状腺组织Fiber-seq、RNA-seq、small RNA-seq、RT-qPCR及报告基因等多层次功能与机制验证。
主要模型
患者甲状腺组织 患者皮肤成纤维细胞 HEK293细胞 COS1细胞
重点核对
STR变异类型（4/3缺失或4/4*点突变） Fiber-seq分析的组织类型（甲状腺组织） 甲状腺组织样本量（2例STRmut，5例正常，1例MNG） RNA-seq和small RNA-seq分析的组织类型（甲状腺组织） 报告基因实验的细胞系（HEK293、COS1）
摘要
促甲状腺激素(TSH)是甲状腺生长和功能的主要调节因子。对TSH的抵抗(RTSH)指的是对TSH敏感性降低的情况。显性遗传的RTSH与染色体15q上的一个位点有关，但其遗传基础一直难以捉摸。在这里，我们展示了在(TTTG)4短串联重复序列(STR)中的非编码突变是12个无关家系中所有82名受影响参与者显性遗传性RTSH的基础。该STR包含在一个灵长类特异性/Alu反转录转座子中，该转座子具有甲状腺特异性的顺式调控染色质特征。Fiber-seq和RNA-seq研究表明，突变型STR激活了一个甲状腺特异性的增强子簇，导致其下游35kb处的双顺反子MIR7-2/MIR1179位点发生单倍型特异性上调，并在参与者的甲状腺细胞中过表达其microRNA产物。这些microRNA所靶向的信号通路失衡为这种RTSH病因提供了一个工作模型。这一发现拓宽了我们目前对改变垂体-甲状腺反馈调节的遗传缺陷的认识。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 显性遗传性促甲状腺激素抵抗（RTSH）在染色体15q25.3-26.1位点的遗传基础是什么？
- 核心机制
- STRmut突变通过改变邻近FOXE1结合元件的间距，稳定转录因子结合，激活一个甲状腺特异性的增强子簇，进而顺式上调下游35kb处的双顺反子MIR7-2/MIR1179位点，导致MIR7-5P等microRNA在甲状腺细胞中过表达，最终引起TSH抵抗。
- 主要证据
- 基于12个家系的全基因组测序、Sanger测序、Fiber-seq、RNA-seq、small RNA-seq和RT-qPCR等实验，证明了STRmut与RTSH的共分离、单倍型特异性增强子激活和miRNA过表达。
- 研究意义
- 该发现首次将STR突变与pri-MIR异常表达联系起来，扩展了对垂体-甲状腺反馈调节遗传缺陷的认识，并提示非编码突变可能解释了多种孟德尔疾病。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
甲状腺组织Fiber-seq染色质分析
评估STRmut是否改变局部染色质可及性和增强子活性。
对2例STRmut患者、1例正常对照和1例MNG对照的甲状腺组织进行Fiber-seq，分析单分子染色质可及性和CpG甲基化。
RNA-seq和small RNA-seq转录组分析
鉴定STRmut对甲状腺转录组和成熟miRNA表达的影响。
对STRmut和STRwt甲状腺组织进行RNA-seq和small RNA-seq，分析差异表达基因和miRNA，并进行等位基因特异性表达分析。
MIR7-5P靶基因和通路分析
探索MIR7-5P过表达对甲状腺细胞信号通路的影响。
结合差异表达基因、GSEA和上游调控因子预测，分析MIR7-5P及其靶基因在STRmut甲状腺中的富集情况，并评估相关信号通路的变化。
TSHR 3'-UTR荧光素酶报告基因实验
验证TSHR是否为MIR7-5P或MIR1179的直接靶基因。
将TSHR 3'-UTR构建到荧光素酶报告基因载体中，在HEK293和COS1细胞中过表达pri-MIR7-2或pri-MIR1179，检测荧光素酶活性变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 甲状腺功能检测 | Elecsys 2010 | Roche Molecular Biochemicals GmbH and Hitachi | -- |
| CpG甲基化分析 | EZ DNA甲基化-金试剂盒 | Zymo Research | -- |
| Fiber-seq | RNasin Plus | Promega | N2615 |
| 蛋白酶抑制剂 | Promega | G6521 | |
| Wizard高分子量DNA提取试剂盒 | Promega | A2920 | |
| RNA-seq | miRNA easy/Rneasy MinElute 纯化试剂盒 | Qiagen | -- |
| NEB Next rRNA去除试剂盒 | NEB | -- | |
| TruSeq链特异性总RNA文库制备试剂盒 | Illumina | -- | |
| NEB Next小RNA文库制备试剂盒 | NEB | -- | |
| RT-qPCR | SYBR Green | Life Technologies | -- |
| miRNA RT-qPCR | TaqMan实时PCR检测 | Applied Biosystems and Thermo Fisher Scientific | -- |
| 5' RACE | GeneRacer试剂盒 | Invitrogen | -- |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| TSHR 3'-UTR报告基因实验 | FuGENE 6转染试剂 | Promega | -- |
| 双荧光素酶检测系统 | Promega | -- | |
| 测序 | HiSeq 4000测序仪 | Illumina | -- |
| Revio测序仪 | PacBio | -- | |
| 统计 | GraphPad Prism软件 | -- | -- |
| 图像定量 | ImageJ软件 | -- | -- |
| PCR产物纯化 | ExoSAP-IT | Thermo Fisher Scientific | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 患者队列和遗传分析 | 家族样本数量、STR突变类型（4/3或4/4*）、WGS测序平台和分析流程 阅读提示：Methods: Human study population, WGS and analysis; 图2和表1 |
| Fiber-seq实验 | 甲状腺组织样本量（2例STRmut、1例正常、1例MNG）、Hia5处理时间、测序平台（PacBio Revio） 阅读提示：Methods: Fiber-seq sample processing and sequencing; 图4 |
| RNA-seq分析 | RNA提取方法（Qiagen miRNA easy/Rneasy）、文库构建试剂盒、测序平台（Illumina HiSeq 4000）、样本量（2例STRmut vs 5例正常） 阅读提示：Methods: High-throughput RNA sequencing, Analysis of RNA-seq data; 图6和7 |
| TSHR 3'-UTR报告基因实验 | 报告基因载体构建（pGL3-promoter）、细胞系（HEK293、COS1）、转染试剂（FuGENE 6）、检测时间（24小时） 阅读提示：Methods: TSHR 3'-UTR luciferase reporter assay; 补充图9 |