LED光漂白系统构建
设计并搭建能够完全漂白透明化肿瘤组织中荧光信号的LED光照射装置，并维持低温条件。
构建了由100W暖白LED芯片、散热器和风扇组成的装置，并放置在含有干冰的冰箱中，样品台温度维持在1-5°C。测量的LED发射光谱覆盖488、561、633 nm。
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基于发光二极管光漂白的光学组织透明化三维免疫荧光显微镜中肿瘤微环境的多重增强
Increased Multiplexity in Optical Tissue Clearing-Based Three-Dimensional Immunofluorescence Microscopy of the Tumor Microenvironment by Light-Emitting Diode Photobleaching
实验完整度
高方法涉及体外细胞培养、小鼠肿瘤模型、组织切片、IF染色、光漂白、共聚焦成像、图像配准和定量分析，有功能验证和治疗实验。
主要模型
400 μm厚TUBO小鼠乳腺肿瘤宏切片 BALB/c小鼠TUBO肿瘤模型 TUBO细胞系
重点核对
LED光漂白系统参数（100W暖白LED芯片，照射距离2.1cm，4°C下照射8小时） 免疫荧光染色条件（抗体浓度0.5-1 mg/mL，染色时间18小时，4°C） 组织透明化处理（D-果糖梯度20%、50%、80%、100%，每步30分钟） 共聚焦成像参数（20X/0.8 NA或40X/1.4 NA物镜，像素尺寸0.614×0.614×3.05 μm^3或0.313×0.313×1.52 μm^3） 图像配准方法（基于DAPI核信号，使用BigWarp和Fijiyama插件）
摘要
光学组织透明化和三维（3D）免疫荧光（IF）显微镜已经改变了对复杂肿瘤微环境（TME）的成像。然而，目前的3D IF显微镜多重能力受限，在透明化的肿瘤组织中只能定位三种或四种细胞和非细胞TME组分。本文报道了一种LED光漂白方法及其在TME三维多重光学映射中的应用。我们构建了一个高功率LED光照射装置和温控室，可在不损害组织和蛋白质抗原完整性的情况下，完全漂白光学透明化的肿瘤组织中的荧光信号。借助新开发的组织安装和选定区域追踪方法，我们建立了一个循环工作流程，包括IF染色、组织透明化、3D共聚焦显微镜和LED光漂白。通过配准三个工作循环产生的显微镜通道图像，我们从单个400 μm厚的肿瘤宏切片中产生了8重图像数据，可在组织广度和细胞水平上以3D形式可视化同一TME中的各种血管、免疫和癌细胞。我们的方法还验证了免疫治疗后TME中细胞重塑的定量3D空间分析。这些结果表明，我们的LED光漂白系统及其工作流程为增强3D IF显微镜的多重能力提供了新方法，用于研究肿瘤异质性和治疗反应。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何提高光学组织透明化三维免疫荧光显微镜对肿瘤微环境的多重成像能力？
- 核心机制
- LED光漂白技术通过高功率暖白光照射完全去除荧光信号，结合循环染色成像工作流程，在不损伤组织的情况下实现多轮标记，从而增加可检测的TME组分数量。
- 主要证据
- 在400 μm厚的TUBO肿瘤宏切片上，通过三个工作循环和LED光漂白，实现了血管细胞（ER-TR7, αSMA, CD31）、免疫细胞（CD8, CD45, CD3）和癌细胞（CK8）的7重成像；并通过DAPI作为参考进行图像配准和3D重建。
- 研究意义
- 该方法提供了一种增加3D免疫荧光显微镜多重能力的途径，有助于研究肿瘤异质性和治疗反应。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
荧光漂白效率验证
评估LED光漂白对透明化肿瘤组织中多种荧光信号的去除效果。
将IF染色的TUBO肿瘤宏切片（用抗ER-TR7-FITC、αSMA-Cy3、CD31-Cy5染色）进行光学透明化后，置于LED装置下照射8小时，监测488、561、633 nm通道的荧光强度变化。
循环多重成像流程
通过反复的染色-成像-光漂白循环，在同一肿瘤宏切片上实现多达7种不同标记物的3D成像。
对TUBO肿瘤宏切片进行三个工作循环：第一循环使用抗ER-TR7-FITC、αSMA-Cy3、CD31-Cy5；第二循环使用抗CD8-DL488、CD45-DL550、CD3-DL633；第三循环使用抗CK8-DL550。每个循环后使用LED光漂白8小时去除荧光。通过DAPI信号作为参考，使用BigWarp和Fijiyama插件进行图像配准。
免疫治疗效应评估
验证该方法在评估免疫治疗对TME影响方面的能力。
对DMXAA处理（10 μL, 1 mg/mL，瘤内注射）和未处理的TUBO肿瘤，进行3D多重成像，并对血管、免疫和癌细胞进行定量空间分析。计算各细胞类型的体积百分比，并评估CD8+ T细胞与癌细胞的相互作用。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 光漂白系统 | 100W暖白LED芯片 | Chanzon Technology | -- |
| 散热片 | -- | -- | |
| 冷却风扇 | -- | -- | |
| 电源 | -- | -- | |
| 冰箱 | -- | -- | |
| 温度计 | -- | -- | |
| 分光光度计 (USB4000) | Ocean Insight | -- | |
| 细胞培养 | 高糖DMEM培养基 | SIGMA | D5671 |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素 | -- | -- | |
| 动物实验 | BALB/c雌性小鼠 | Envigo | -- |
| 胰岛素注射器（29G × 1/2英寸） | Exel Comfort Point | 26029 | |
| 药物处理 | DMXAA | MilliporeSigma | D5817 |
| 抗体标记 | 异硫氰酸荧光素 | MilliporeSigma | F7250 |
| 磺化Cy3-NHS酯 | Lumiprobe | 11320 | |
| 磺化Cy5-NHS酯 | Lumiprobe | 13320 | |
| DyLight 488-NHS酯 | Thermo Scientific | 46402 | |
| DyLight 550-NHS酯 | Thermo Scientific | 62262 | |
| DyLight 633-NHS酯 | Thermo Scientific | 46414 | |
| 透析袋（MWCO 10K） | Thermo Scientific | -- | |
| 组织处理 | 琼脂糖凝胶（LE快速溶解琼脂糖） | GeneMate | -- |
| 振动切片机 (VT1200S) | Leica | -- | |
| 免疫荧光染色 | DAPI | Thermo Scientific | 62248 |
| RPMI1640培养基 | Gibco | 22400089 | |
| 牛血清白蛋白 | MilliporeSigma | A2058 | |
| 组织透明化 | D-果糖 | MilliporeSigma | F0127 |
| 3D成像 | 正置共聚焦显微镜 (RS-G4) | Caliber ID | -- |
| 20X/0.8 NA干物镜 (UPLXAPO20X) | Olympus | -- | |
| 40X/1.4 NA油物镜 (UPLXAPO40XO) | Olympus | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| LED光漂白系统设置 | LED芯片型号和功率（100W暖白）、照射距离（2.1 cm）、样品台温度（1-5°C）、照射时间（8小时） 阅读提示：Methods - LED photobleaching system 和 Figure 1 |
| 肿瘤模型建立 | TUBO细胞注射数量（2×10^5）、注射部位（第4乳腺脂肪垫）、肿瘤大小（5-8 mm） 阅读提示：Methods - Mouse tumor model and treatment with DMXAA |
| 免疫荧光染色 | 抗体浓度（0.5-1 mg/mL）、染色时间（18小时）、温度（4°C）、抗体组合 阅读提示：Methods - Fluorescent antibodies 和 Tissue processing, immunofluorescence staining, and optical clearing 以及 Table 1, 2 |
| 组织透明化 | D-果糖浓度梯度（20%, 50%, 80%, 100%）、每步处理时间（30分钟）、温度（4°C） 阅读提示：Methods - Tissue processing, immunofluorescence staining, and optical clearing |
| 3D共聚焦成像 | 显微镜型号、物镜（20X/0.8 NA 或 40X/1.4 NA）、扫描分辨率（0.614×0.614×3.05 μm^3 或 0.313×0.313×1.52 μm^3）、帧平均（8）、激发和发射滤光片设置 阅读提示：Methods - 3D confocal fluorescence microscopy |
| 图像配准和重建 | 配准工具（BigWarp, Fijiyama）、配准方法（基于DAPI参考）、变换类型（Thin Plate Spline 或 Rigid） 阅读提示：Methods - Construction and processing of 3D multiplex tumor images |