基于LED光漂白的光学组织透明化三维免疫荧光显微成像技术用于肿瘤微环境的多重光学定位

光学组织透明化与三维（3D）免疫荧光显微技术正在革新复杂肿瘤微环境的成像研究。然而，当前的三维免疫荧光显微技术存在多重标记限制：在透明化肿瘤组织中通常仅能定位3至4种细胞与非细胞成分。本研究报道了一种发光二极管光漂白方法及其在肿瘤微环境三维多重光学成像中的应用。我们构建了高功率LED光照射装置与温控腔室，可在不损伤组织及蛋白抗原完整性的前提下，完全漂白整个透明化肿瘤组织中的荧光信号。通过新开发的样本装载方法与选定区域追踪技术，我们建立了包含免疫荧光染色、组织透明化、三维共聚焦显微成像和LED光漂白的循环工作流程。通过对三个工作周期产生的显微通道图像进行配准，我们从400微米厚的肿瘤大切片中获得了八重标记的三维图像数据，实现了在组织尺度与细胞层面上对同一肿瘤微环境中各类血管、免疫细胞及癌细胞的三维可视化。该方法在免疫治疗后肿瘤微环境细胞结构重塑的定量三维空间分析中也得到验证。这些结果表明，我们的LED光漂白系统及其工作流程为提升三维免疫荧光显微技术的多重标记能力提供了创新方案，可用于研究肿瘤异质性及治疗响应机制。