建立肥胖诱导的HCC小鼠模型并验证
模拟人类NAFLD-NASH-HCC进展，并验证模型中的代谢和炎症特征
给6周龄C57BL/6J小鼠喂食CD-HFD或对照饮食长达15个月，检测体重、脂肪量、葡萄糖耐量、胰岛素敏感性、肝脏脂质积累、炎症和纤维化。
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脂肪酸结合蛋白5的抑制通过促进铁死亡和瘤内免疫重塑减轻肥胖诱导的肝细胞癌
Fatty acid binding protein 5 suppression attenuates obesity-induced hepatocellular carcinoma by promoting ferroptosis and intratumoral immune rewiring
实验完整度
高包括体外细胞实验（Huh7、BMDM）、动物模型（CD-HFD诱导HCC、MC38移植瘤）、基因敲除小鼠（Fabp5HKO）、单细胞转录组及代谢通量分析，并进行了功能验证和机制验证。
主要模型
CD-HFD诱导的肥胖相关HCC小鼠模型 肝细胞特异性FABP5敲除小鼠（Fabp5HKO） Huh7人肝癌细胞系 MC38皮下移植瘤模型
重点核对
CD-HFD喂养时间（15个月）及对照组饮食 SBFI-103给药剂量（15 mg/kg，腹腔注射）和频率（每两天一次，共3个月） FABP5 siRNA处理浓度和时间（5 μM，48小时） CD-HFD诱导HCC的动物数量（每组n=11-20） BMDM与OT-I T细胞共培养的比例（1:5）和SIINFEKL肽浓度（100 ng/ml）
摘要
由于营养过剩的加剧，肥胖诱导的肝细胞癌（HCC）的发病率将持续上升；然而，我们对肥胖到HCC发展轴的理解有限。我们构建了一个单细胞图谱，以探究小鼠肝癌发生过程中的动态转录组变化。在这里，我们确定脂肪酸结合蛋白5（FABP5）是肥胖诱导的HCC的一个驱动因素。对转化细胞的分析表明，FABP5的抑制和沉默使癌细胞易于发生脂质过氧化和铁死亡诱导的细胞死亡。FABP5的药理学抑制和基因消融可减轻雄性小鼠的HCC负担，这与肿瘤中增强的铁死亡相对应。此外，FABP5抑制诱导一种促炎性肿瘤微环境，其特征是肿瘤相关巨噬细胞共刺激分子CD80和CD86表达增加，以及CD8+ T细胞活化增加。我们的工作揭示了FABP5在饮食诱导的HCC中的双重功能作用，诱导肝细胞的转化和肿瘤相关巨噬细胞的免疫抑制表型，并说明FABP5抑制作为一种潜在的治疗方法。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- FABP5在肥胖诱导的肝细胞癌发生发展中的作用及其机制是什么？
- 核心机制
- FABP5在肿瘤细胞中抑制脂质过氧化和铁死亡，在肿瘤相关巨噬细胞中维持免疫抑制表型；FABP5抑制通过促进铁死亡和增强CD8+ T细胞活化来抑制HCC进展。
- 主要证据
- scRNA-seq鉴定FABP5在AFP+癌细胞中上调；SBFI-103处理和FABP5 siRNA增加Huh7细胞脂质过氧化和铁死亡；SBFI-103处理减少CD-HFD小鼠HCC负担并增加瘤内铁死亡；Fabp5HKO小鼠HCC发生率降低；SBFI-103处理增加TAM中CD80/CD86表达和CD8+ T细胞增殖。
- 研究意义
- FABP5抑制可能是一种针对肥胖诱导的HCC的双靶点治疗策略，同时作用于肿瘤细胞和肿瘤微环境。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
单细胞转录组图谱分析
描绘HCC进展过程中不同细胞类型的转录组变化，识别关键驱动基因
对15个月CD-HFD或ND喂养的小鼠肝脏细胞进行scRNA-seq，包括实质细胞和非实质细胞，将细胞聚类并注释，进行拟时间分析以追踪肝细胞向癌细胞转化过程中的基因表达变化。
体外验证FABP5对癌细胞铁死亡的影响
验证FABP5抑制或沉默是否增加癌细胞对脂质过氧化和铁死亡的敏感性
用SBFI-103（5 μM）或FABP5 siRNA处理Huh7细胞48小时，检测脂质摄取、脂质过氧化（MDA、BODIPY 581/591 C11）、ROS（CellROX）、ER应激蛋白（PERK、ATF4、IRE1A、BIP）和细胞死亡。
体内验证FABP5药理学抑制对HCC的影响
确定FABP5抑制能否减轻CD-HFD诱导的HCC负担并促进肿瘤铁死亡
CD-HFD喂养12个月后，给小鼠腹腔注射SBFI-103（15 mg/kg，每两天一次）或载体，持续3个月。评估肿瘤发生率、结节数、体积、AFP水平、增殖/凋亡标志物、YAP信号通路、脂质过氧化和铁死亡标志物。
遗传消融验证FABP5在肝细胞中的功能
确定肝细胞特异性FABP5缺失是否保护小鼠免受HCC发展
生成Fabp5flox/flox;AlbCreERT2小鼠，他莫昔芬诱导敲除肝细胞FABP5，CD-HFD喂养15个月，评估肿瘤负担、AFP水平、脂质过氧化和铁死亡标志物。
评估FABP5抑制对肿瘤微环境的免疫重塑作用
确定FABP5抑制是否改变肿瘤免疫细胞组成和功能
对SBFI-103处理的HCC组织进行scRNA-seq，分析免疫细胞亚群，通过流式细胞术验证巨噬细胞表型（CD80/CD86、Ly6C）和T细胞活化（CD44/CD62L、Ki67），RNAscope验证空间分布。在MC38模型中验证其普适性。
体外共培养验证FABP5在巨噬细胞中的作用
确定FABP5抑制巨噬细胞是否增强CD8+ T细胞的活化和杀伤能力
用IL-4极化BMDMs并给予SBFI-103或siRNA处理，与OT-I T细胞和B16-OVA细胞共培养，检测T细胞活化标志物、增殖和细胞毒性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 饮食诱导 | 胆碱缺乏高脂饮食 | Research Diets | D05010402 |
| 对照饮食 | 对照饮食 | Research Diets | D12450H |
| FABP5抑制 | SBFI-103 | Stony Brooks University | -- |
| FABP5敲低 | FABP5 siRNA | Dharmacon | L-008710-00-0010 |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| RPMI 1640培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | R&D Systems | -- | |
| L-谷氨酰胺 | Sigma | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | -- | |
| 胶原酶I | Sigma | SCR103 | |
| 脱氧核糖核酸酶I | Roche | 4716728001 | |
| Percoll分离液 | Sigma | P1644 | |
| 流式细胞术 | LIVE/DEAD固定性Aqua死细胞染色试剂盒 | Invitrogen | L34957 |
| 红细胞裂解液 | Roche | 11814389001 | |
| PMA/离子霉素细胞刺激混合物 | Invitrogen | 00-4970-93 | |
| 细胞增殖检测 | CellTrace Violet细胞增殖染料 | Invitrogen | C34557 |
| 脂质过氧化检测 | 丙二醛检测试剂盒 | Abcam | Ab118970 |
| BODIPY 581/591 C11荧光探针 | Invitrogen | D3861 | |
| 活性氧检测 | CellROX活性氧检测试剂 | Invitrogen | C10444 |
| 二氢乙啶 | -- | -- | |
| 脂肪酸摄取检测 | BODIPY FL C16荧光脂肪酸 | Invitrogen | D3821 |
| 葡萄糖摄取检测 | 2-NBDG荧光葡萄糖类似物 | Invitrogen | N13195 |
| 代谢分析 | Seahorse XF96 V3-PS细胞培养微孔板 | Agilent | 101085-004 |
| BSA偶联棕榈酸 | Sigma | P9767 | |
| 左旋肉碱 | Sigma | A6706 | |
| 依托莫昔 | Cayman Chemical | 828934-41-4 | |
| 寡霉素 | Sigma | 75351 | |
| FCCP解偶联剂 | Sigma | C2920 | |
| 鱼藤酮 | Sigma | R8875 | |
| RIPA裂解液 | -- | -- | |
| Pierce BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo | 23227 | |
| Western blot | 蛋白酶抑制剂混合物 | Abcam | ab271306 |
| 免疫组化 | 抗FABP5抗体 | R&D Systems | AF1476 |
| 免疫荧光 | 抗AFP抗体 | Proteintech | 14550-1-AP |
| 抗CD68抗体 | Bio-Rad | MCA1957 | |
| 鬼笔环肽-Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher | A22287 | |
| DAPI染料 | Vector Laboratories | H-1200 | |
| RNAscope | RNAscope多重荧光试剂盒v2 | ACD Bio | 320293 |
| PCR | RNeasy小型RNA提取试剂盒 | QIAGEN | -- |
| iScript cDNA合成试剂盒 | Bio-Rad | -- | |
| SsoFast EvaGreen预混液 | Bio-Rad | -- | |
| 细胞凋亡检测 | TUNEL检测试剂盒 | QIAGEN | 74104 |
| 细胞培养 | 重组小鼠IL-4 | Peprotech | 214-14 |
| 精氨酸酶活性检测 | 精氨酸酶活性检测试剂盒 | Abcam | Ab180877 |
| 抗原递呈 | SIINFEKL肽 | Sigma | S7951 |
| 细胞毒性检测 | NucView 488 caspase-3底物 | Biotium | 10405 |
| GolgiPlug蛋白转运抑制剂 | BD | 555029 | |
| 生化检测 | ALT活性检测试剂盒 | Abcam | ab105134 |
| AST活性检测试剂盒 | Sigma | MAK055 | |
| AFP ELISA试剂盒 | R&D Systems | MAFP00 | |
| 脂质检测 | 甘油三酯检测试剂盒 | Abcam | Ab206386 |
| 胆固醇检测试剂盒 | Wako | 999-02601 | |
| 油红O | Sigma | O0625 | |
| 组织固定 | 福尔马林 | Sigma | -- |
| 组织学 | 蔗糖 | Sigma | S0389 |
| Triton X-100去垢剂 | Sigma | T8787 | |
| IHC | 过氧化氢 | Sigma | H1009 |
| 驴血清 | Sigma | D9663 | |
| 生物素化兔抗羊IgG | Jackson | 305-065-046 | |
| 链霉亲和素过氧化物酶 | Rockland | S000-03 | |
| DAB底物 | Rockland | DAB-10 | |
| 显微镜 | EVOS XL Core显微镜 | Thermo Scientific | AMEX1000 |
| Motic EasyScan Infinity 60扫描仪 | Motic | -- | |
| SELLARIS共聚焦显微镜 | Leica | -- | |
| 流式细胞术 | LSR II流式细胞仪 | BD | -- |
| FACSAria II流式分选仪 | BD | -- | |
| Western blot | Odyssey红外成像系统 | LI-COR | -- |
| 血糖检测 | Contour Ultra血糖仪 | Bayer | -- |
| 葡萄糖耐受测试 | 葡萄糖 | Thermo | A16828.0C |
| 胰岛素耐受测试 | 胰岛素 | Gibco | 12585014 |
| 电镜 | 醋酸铀酰 | Fisher Scientific | 18-607-646 |
| Poly/bed 812环氧树脂 | Polysciences | 08792-1 | |
| 代谢通量分析 | [1,2,3,4,5,6,6-2H7]葡萄糖 | -- | -- |
| [3-13C]乳酸钠 | -- | -- | |
| RNA-seq | RNeasy Plus微量RNA提取试剂盒 | QIAGEN | -- |
| TrueSeq小RNA文库制备试剂盒 | Illumina | -- | |
| 单细胞测序 | 单细胞3'试剂盒v2 | 10x Genomics | -- |
| HiSeq 4000测序仪 | Illumina | -- | |
| RNA-seq | NovaSeq测序平台 | Illumina | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型 | 小鼠品系、年龄、性别、饮食类型、喂养时长 阅读提示：Methods: Mice |
| FABP5抑制处理 | SBFI-103剂量、给药途径、频率、持续时间 阅读提示：Methods: SBFI-103 administration in animals, cell lines and primary cells |
| 细胞实验 | 细胞系、培养条件、处理浓度和时间 阅读提示：Methods: Cell lines and primary cell culture |
| 脂质过氧化和铁死亡检测 | MDA、BODIPY C11、CellROX检测步骤、细胞密度和染色时间 阅读提示：Methods: Lipid peroxidation measurements |
| 巨噬细胞与T细胞共培养 | BMDM分化条件、IL-4浓度、SBFI-103/siRNA浓度、共培养比例和时长 阅读提示：Methods: Antigen-presenting assay and CD8+ T cell co-culture |
| 单细胞转录组测序 | 细胞制备、建库试剂盒、测序平台和参数 阅读提示：Methods: Droplet-based scRNA-seq library construction |