R-loop水平检测与IGF2BP结合验证
验证前列腺癌中R-loop水平变化及IGF2BPs与R-loop的结合
通过S9.6抗体dot-blot检测临床组织和细胞系中的R-loop水平；通过S9.6 IP和Western blot验证IGF2BPs与R-loop的结合。
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前列腺癌中共转录R-loop介导的表观遗传调控驱动生长阻滞和多西他赛化疗敏感性增强
Co-transcriptional R-loops-mediated epigenetic regulation drives growth retardation and docetaxel chemosensitivity enhancement in advanced prostate cancer
实验完整度
高包含体外细胞实验、动物模型、临床样本、组学分析等多层级验证，并明确功能验证（增殖、迁移、化疗敏感性）和机制验证（R-loop、DNA甲基化、Hippo通路）。
主要模型
前列腺癌细胞系（DU-145、PC-3等） 前列腺癌临床组织样本 裸鼠皮下移植瘤模型 裸鼠尾静脉转移模型
重点核对
R-loop水平通过S9.6抗体dot-blot检测，以RNaseH1处理为阴性对照 IGF2BPs过表达通过质粒转染，使用Myc标签抗体验证 SEMA3F过表达对多西他赛化疗敏感性的影响通过克隆形成实验评估，以DMSO处理为对照 LATS1抑制剂TDI-011536处理对Hippo通路和多西他赛敏感性的影响 RBM15敲除通过CRISPR-Cas9实现，影响R-loop m6A修饰
摘要
R-loop是一种普遍存在的三链核酸结构，包含一个DNA-RNA杂交体和一条被置换的单链DNA，常在转录过程中形成，可能有助于基因组稳定性和基因表达调控。最近发现RNA修饰如N6-甲基腺嘌呤（m6A）有助于维持R-loop的稳定性。然而，m6A修饰的R-loop在调控基因转录中的作用仍知之甚少。在此，我们证明了胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白（IGF2BPs）以m6A依赖的方式识别R-loop。因此，IGF2BPs过表达通过阻碍DNA甲基转移酶1（DNMT1）与信号素3F（SEMA3F）启动子的结合，导致前列腺癌（PCa）中总体R-loop水平升高、细胞迁移抑制和细胞生长阻滞。此外，IGF2BPs的K同源（KH）结构域对于其识别含m6A的R-loop以及肿瘤抑制功能是必需的。SEMA3F的过表达通过调控Hippo通路显著增强了前列腺癌对多西他赛的化疗敏感性。我们的发现揭示了一种由IGF2BPs介导的独特R-loop解离途径，强调了IGF2BPs作为表观遗传R-loop阅读器在转录遗传调控和癌症生物学中的功能重要性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- IGF2BPs如何以m6A依赖方式调节共转录R-loop，并影响前列腺癌的进展及化疗敏感性？
- 核心机制
- IGF2BPs以m6A依赖方式结合R-loop，通过KH结构域识别，阻碍DNMT1和YTHDF2与靶基因启动子结合，从而减少DNA甲基化，上调SEMA3F表达，进而激活Hippo通路，抑制细胞增殖和迁移并增强多西他赛敏感性。
- 主要证据
- 通过S9.6 IP、RNA pull-down、DRIP-seq、ChIP-qPCR、细胞增殖/迁移实验、动物模型及临床样本分析，证明IGF2BPs调控R-loop和DNA甲基化，SEMA3F过表达激活Hippo通路并增强化疗敏感性。
- 研究意义
- 该研究首次强调IGF2BPs作为表观遗传R-loop阅读器在转录调控和癌症生物学中的功能重要性，并提供一个新颖的RBM15/IGF2BPs/DNMT1转组学调控m6A轴，提示RNA m6A甲基化与DNA甲基化在前列腺癌中的新型串扰，SEMA3F可能成为预测前列腺癌风险的生物标志物。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
IGF2BPs对m6A-R-loop的结合偏好及R-loop积累
验证IGF2BPs是否优先结合含m6A的RNA-DNA杂交体，并影响R-loop水平
使用RNA pull-down实验和Western blot检测IGF2BPs对m6A修饰探针的结合；通过dot-blot检测IGF2BPs过表达对R-loop水平的影响。
IGF2BPs KH结构域功能分析
验证KH结构域在IGF2BPs识别m6A-R-loop和调控R-loop积累中的作用
构建KH突变体，通过dot-blot、RNA pull-down和免疫荧光实验评估突变体对R-loop结合和积累的影响。
YTHDF2与R-loop的相互作用
验证YTHDF2是否也参与R-loop代谢，并探究IGF2BPs对其影响
通过S9.6 IP、RNA pull-down和dot-blot检测YTHDF2与R-loop的结合及敲低后的R-loop水平。
转录组和R-loop全基因组分析
探究IGF2BPs过表达对全基因组R-loop分布和基因表达的影响，并筛选靶基因
进行RNA-seq和DRIP-seq，分析R-loop在启动子区域的积累及与基因表达的相关性，并结合m6A-DIP-seq筛选共同靶基因。
DNA甲基化调控机制研究
验证IGF2BPs是否通过阻碍DNMT1结合减少DNA甲基化上调靶基因表达
通过DNA pull-down、ChIP-qPCR分析DNMT1与SEMA3F启动子的结合，并通过MethylationEPIC芯片检测启动子甲基化水平。
RBM15介导R-loop m6A修饰
探究RBM15是否负责R-loop的m6A修饰，并影响R-loop水平
通过S9.6 IP、共定位、dot-blot和MeDIP-qPCR验证RBM15与R-loop结合及对其m6A修饰的影响。
体内外肿瘤抑制功能验证
验证IGF2BPs和RBM15在体内外是否抑制肿瘤生长和转移
通过细胞增殖、迁移实验和裸鼠皮下移植、尾静脉转移模型，评估IGF2BPs和RBM15过表达的效果。
SEMA3F功能及化疗敏感性研究
验证SEMA3F过表达对细胞增殖、迁移、Hippo通路及多西他赛敏感性的影响
通过细胞增殖迁移实验、Western blot检测Hippo通路蛋白、克隆形成实验评估多西他赛敏感性，并用LATS1抑制剂处理验证通路。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 免疫沉淀和免疫印迹 | S9.6抗体 | Sigma | MABE1095 |
| 免疫印迹 | Myc标签抗体 | Abcam | ab32 |
| IGF2BP1抗体 | Abcam | ab290736 | |
| IGF2BP2抗体 | Abcam | ab128175 | |
| IGF2BP3抗体 | Abcam | ab177477 | |
| RBM15抗体 | Proteintech | 10587-1-AP | |
| DNMT1抗体 | Abcam | ab92314 | |
| DNMT3A抗体 | Abcam | ab307503 | |
| DNMT3B抗体 | Cell Signaling Technology | 67259 | |
| SEMA3F抗体 | Sigma | SAB2107196 | |
| DNA甲基化检测 | 5-甲基胞嘧啶抗体 | Abcam | ab214727 |
| RNA修饰检测 | m6A抗体 | Sigma | SAB5600251 |
| 免疫印迹 | YAP1磷酸化抗体 | Abcam | ab76252 |
| YAP1抗体 | Proteintech | 66900-1-Ig | |
| LATS1抗体 | Proteintech | 66569-1-Ig | |
| LATS2抗体 | Proteintech | 20276-1-AP | |
| β-肌动蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 4970 | |
| 转染 | Polyplus转染试剂 | Polyplus | -- |
| 免疫沉淀 | 蛋白A/G磁珠 | MCE | -- |
| RNA pull-down | Pierce磁力RNA-蛋白Pull-down试剂盒 | ThermoFisher | 20164 |
| LC-MS/MS | EASY-nLC 1000超高效液相色谱系统 | Thermo | -- |
| Q ExactiveTM Plus质谱仪 | Thermo | -- | |
| 蛋白质鉴定 | Proteome Discoverer 2.4软件 | -- | -- |
| 斑点印迹 | Hybond N+膜 | GE health | -- |
| 斑点印迹装置 | Bio-rad | -- | |
| 亚甲蓝 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 免疫荧光 | STEDYCON共聚焦显微镜 | -- | -- |
| 图像处理 | Image J软件 | -- | -- |
| Adobe Photoshop软件 | -- | -- | |
| RNA提取 | RNAiso Plus试剂 | Takara | -- |
| DNA甲基化芯片 | MethylationEPIC (850K) BeadChip芯片 | Illumina | -- |
| NanoDrop 2000分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| EZ DNA甲基化-Gold试剂盒 | Zymo Research | -- | |
| Illumina iSCAN扫描仪 | Illumina | -- | |
| 数据分析 | ChAMP软件 | -- | -- |
| GraphPad Prism 9.0软件 | -- | -- | |
| 测序 | Illumina测序平台 | Illumina | -- |
| 数据分析 | HISAT2软件 | -- | -- |
| DESeq2软件 | -- | -- | |
| Integrative Genomics Viewer (IGV)软件 | -- | -- | |
| MEXPRESS数据库 | -- | -- | |
| GEPIA门户 | -- | -- | |
| TCGA数据库 | -- | -- | |
| starBase在线数据库 | -- | -- | |
| LinkedOmics在线数据库 | -- | -- | |
| SRAMP软件 | -- | -- | |
| 韦恩图工具 | -- | -- | |
| 基因敲除 | CRISPR-Cas9技术 | -- | -- |
| 质粒构建 | pLentiCRSPIR V2载体 | Genscript | -- |
| pcDNA3载体 | Shanghai Yoche Biotechnology | -- | |
| h-RBM15-pcDNA3.1-c-HA质粒 | Guangzhou FulenGen | -- | |
| M35-FLAG-SEMA3F质粒 | Guangzhou FulenGen | -- | |
| 慢病毒包装 | pReceiver-Lv242-FLAG载体 | Guangzhou FulenGen | -- |
| RNA合成 | 3'生物素标记单链RNA | TsingKe Biotech | -- |
| 互补单链DNA | TsingKe Biotech | -- | |
| 免疫沉淀 | ChIP试剂盒 | Merck and Millipore | -- |
| DNA纯化 | PCR纯化柱 | Thermo Fisher | -- |
| DNA甲基化 | 3-脱氮腺苷 | -- | -- |
| 小鼠模型 | 裸鼠 | -- | -- |
| 药物处理 | 多西他赛 | -- | -- |
| TDI-011536（LATS1抑制剂） | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与转染 | 细胞系来源、培养条件、转染试剂（Polyplus）及质粒浓度 阅读提示：Methods: Cell lines and transfection |
| R-loop检测 | S9.6抗体使用浓度、dot-blot上样量、RNaseH1处理条件 阅读提示：Methods: Dot-blot; Figure legends 1, 2, 3 |
| RNA pull-down | 探针序列、m6A修饰位置、pull-down试剂盒（Pierce） 阅读提示：Methods: In vitro RNA-protein pulldown assays; Figure legends 2, 3 |
| DRIP-seq和MeDIP | 基因组DNA片段化大小、抗体用量、免疫沉淀条件 阅读提示：Methods: DRIP-seq and m6A DIP; Figure legends 5, 7 |
| ChIP | 固定条件、超声参数、抗体、洗涤和洗脱条件 阅读提示：Methods: ChIP; Figure legends 6, 7 |
| 动物实验 | 小鼠品系、注射细胞数量、观测时间、统计学方法 阅读提示：Methods: Animal models; Figure legends 8, 9 |
| 化疗敏感性实验 | 多西他赛浓度、处理时间、DMSO对照、细胞活力检测方法 阅读提示：Figure legend 10；Results: SEMA3F |